HPLC法分析8%春雷霉素.噻霉酮悬浮剂*

包 娜，杨昌彪，马 凯，廖朝选，段亚玲，龚会琴

(贵州省分析测试研究院，贵州 贵阳 550002)

春雷霉素(Kasugamycin)，是一种高效、广谱、低毒、无公害的氨基糖苷类抗生素杀菌剂，是放线菌产生的代谢产物，具有极强的内吸渗透性[1]，对细菌和真菌都有很好的预防及治疗效果，广泛用于水稻、瓜果、蔬菜等作物中的多种真菌和细菌性病害防治[2]。噻霉酮(Benziothiazolinone)，是一种新型、广谱、高效的有机杂环类杀菌剂，对细菌、真菌类病害具有很强的抑制作用，具有低毒、低残留，对环境安全等优点，这两种农药均可有效防治烟草野火病、水稻稻瘟病、柑橘溃疡病、黄瓜细菌性角斑病等[3]，且田间药效试验表明，二者混剂对番茄斑疹病的防治效果显著高于单剂[4]。

目前春雷霉素和噻霉酮单剂的分析方法已见报道。春雷霉素单剂的分析方法主要有反相液相色谱法[5]、液相色谱串联质谱法[6-7]、离子对反相液相色谱法[8-9]、高效毛细管电泳法[9]等。噻霉酮单剂的分析方法主要有液相色谱法[10-12]和液相色谱-串联质谱法[13-14]，还有研究采用了液相串联质谱联用法对该两种化合物在柑橘中的残留情况进行了同时分析，但是该方法前处理麻烦、操作繁琐，成本高，不适合制剂中有效成分含量的快速检测，目前对悬浮制剂中该两种化合物的有效成分进行同时分析的方法研究还未见公开报道。

试验建立了一种高效液相色谱法，可对8%春雷霉素.噻霉酮悬浮剂中的春雷霉素和噻霉酮同时进行定量分析，此方法具操作简单、快速、准确度和精密度高、分离效果好等优点，可为产品的生产和质量控制提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1260 Ⅱ(具DAD检测器)；色谱柱：ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm(id)，5 μm)；明澈超纯水制备系统；超声波清洗仪。

甲醇(色谱纯)，磷酸(分析纯)，春雷霉素盐酸盐标样(ω=87.9%)，噻霉酮标样(ω=99.57%)，超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm，25 ℃)，十二烷基硫酸钠(分析纯)、8%春雷霉素.噻霉酮悬浮剂(春雷霉素质量分数为6%，噻霉酮质量分数为2%)。

1.2 色谱操作条件及分析方法

检测波长：215 nm；进样体积：5 μL；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；运行时间：15.0 min；流动相：甲醇+水(0.2%十二烷基硫酸钠，用磷酸调pH至2.5)=55+45(V/V)。

试样溶液和标准混合溶液色谱图见图1、图2。

图1 标样溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of standard solution

图2 试样溶液色谱图Fig.2 Chromatogram of sample solution

1.3 标样溶液的配制

准确称取噻霉酮标样0.02 g(精确至0.0002 g)、春雷霉素盐酸盐标样0.05 g(精确至0.0002 g)于50 mL容量瓶中，用甲醇水混合液(体积比为1:1)溶解并定容至刻度，超声5 min，冷却至室温，配成春雷霉素盐酸盐和噻霉酮的混合标准储备液。

移取春雷霉素盐酸盐和噻霉酮的混合标准储备液5.00 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇水混合液(体积比为1:1)溶解并定容至刻度，摇匀，配制成春雷霉素盐酸盐和噻霉酮的混合标准溶液。

1.4 计 算

将测得的2针试样溶液及试样前后2针标样溶液中的春雷霉素盐酸盐/噻霉酮峰面积分别进行平均。2次平行测定结果相对偏差应不大于2%，取其算数平均值作为结果。试样中噻霉酮的质量分数按式(1)计算、春雷霉素的质量分数按式(2)计算。

(1)

式中：W1为噻霉酮质量分数，%；A1为标样溶液中噻霉酮峰面积的平均值；A2为试样溶液中噻霉酮峰面积的平均值；m1为噻霉酮标样的质量，g；m2为试样的质量，g；P1为噻霉酮标样的质量分数，%。

(2)

式中：W2为春雷霉素质量分数，%；A3为标样溶液中春雷霉素盐酸盐峰面积的平均值；A4为试样溶液中春雷霉素盐酸盐峰面积的平均值；m3为春雷霉素盐酸盐标样的质量，g；m2为试样的质量，g；P2为春雷霉素盐酸盐标样的质量分数，%；379.36为春雷霉素相对分子质量，g；415.82为春雷霉素盐酸盐相对分子质量，g。

2 结果与分析

2.1 吸收波长的选择

采用DAD检测器对春雷霉素和噻霉酮标准溶液进行检测，分析其3D图谱，试验结果表明春雷霉素和噻霉酮在190～260 nm均有较大吸收，综合考虑溶剂吸收、杂质干扰等因素的影响，将检测波长设为215 nm，噻霉酮和喹啉铜的紫外吸收光谱图见图3、图4。

图3 噻霉酮紫外-可见吸收光谱图Fig.3 The UV-Vis absorption spectrum of benziothiazolinone

图4 春雷霉素紫外-可见吸收光谱图Fig.4 The UV-Vis absorption spectrum of kasugamycin

2.2 线性相关性实验

分别移取适量上述配制的春雷霉素盐酸盐和噻霉酮的混合标准储备液置于10 mL容量瓶中，用甲醇水混合液(体积比为1:1)稀释并定容至刻度，摇匀，配制系列梯度混合标准工作溶液。在上述色谱操作条件下进行分析，得到春雷霉素盐酸盐、噻霉酮的峰面积。然后分别以春雷霉素盐酸盐、噻霉酮标样溶液质量浓度为横坐标，以春雷霉素盐酸盐、噻霉酮标样溶液峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

试验结果表明：春雷霉素盐酸盐、噻霉酮的质量浓度与峰面积之间的线性关系均良好，春雷霉素盐酸盐线性方程为y=4.96x+15.32，R2为0.9998；噻霉酮线性方程为y=22.25x-85.07，R2为0.9996，完全满足试验要求。

2.3 精密度实验

表1 精密度测定结果Table 1 Results of precision

从同一样品中分别准确称取0.4 g(精确至0.0002 g)试样5份于50 mL容量瓶中，分别用甲醇水混合液(体积比为1:1)溶解并定容至刻度，超声5 min，冷却至室温，过膜，备用。在上述色谱操作条件下进行精密度测定，测定结果见表1。

试验结果表明：春雷霉素变异系数为0.46%，噻霉酮变异系数为0.37%，该分析方法精密度良好，可满足日常定量分析的要求。

2.4 准确度实验

表2 准确度测定结果Table 2 Results of accuracy

试验结果表明：春雷霉素的平均回收率为101.7%，噻霉酮的平均回收率为100.0%，该分析方法准确度高，可满足日常定量分析的要求。

3 结 论

试验建立了一种8%春雷霉素.噻霉酮悬浮剂中有效成分的分析方法。该方法可同时测定悬浮制剂中的春雷霉素和噻霉酮含量，其在设定的浓度范围内线性关系良好，方法的准确度和精密度高，重现性好，具操作简单、快速、结果准确、分离效果好等优点，可用于生产过程质量检测与质量控制。