盐度对不同蜕皮时期罗氏沼虾生理生化及蜕皮相关基因表达的影响

黎兰诗，戴习林*

（1水产科学国家级实验教学示范中心（上海海洋大学），上海 201306；2水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心（上海海洋大学），上海 201306）

0 引言

【研究意义】罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）属大型的淡水虾类，具有生长快、养殖周期短、营养价值高等优点，是我国主要的淡水虾养殖品种（姜建萍等，2019）。甲壳动物在生长发育过程中均需要经历多个蜕皮周期，主要分为蜕皮后早期A、蜕皮后晚期B、蜕皮间期C、蜕皮前期D和蜕皮期E（叶城凯等，2019）。在高密度集约化养殖环境中，甲壳动物处于蜕皮期时，是其整个生命最脆弱的阶段，也是最容易发生同类相残的时候（Abu et al.，2020），水产生物经常受到生存环境中各种环境因子的刺激，从而使其蜕皮生理生化指标等发生变化，延长了生产周期，经济效益下降，因此，研究环境因子与甲壳动物蜕皮之间的关系尤为重要（李江涛等，2021；李安涵，2020）。监测环境胁迫下虾类的生理变化，确保虾类处于最佳的养殖环境，是虾类集约化养殖的重点。因此，研究盐度对不同蜕皮时期罗氏沼虾生理生化及蜕皮相关基因表达的影响对罗氏沼虾培育具有重要的意义。【前人研究进展】盐度作为虾类养殖环境的一个重要理化因子，与虾类的渗透压、能量代谢和行为等密切相关（Chand et al.，2015）。能量代谢最主要的途径包括糖酵解、三羧酸循环、氧化磷酸化等。三羧酸循环将葡萄糖氧化为机体提供能量，琥珀酸脱氢酶（Scinate dhydrogenase，SDH）活力大小可反映有氧代谢水平（戴超等，2013）。丙酮酸激酶（Pyruvatekinase，PK）是最典型的限速调节酶，在糖酵解的过程中主要作用是控制速率，其活力的大小在一定程度可直观体现糖酵解的能力（Laiz-Carrión et al.，2003）。蜕皮抑制激素（Molt-inhibiting hormone，MIH）、蜕皮激素受体（Ecdysteroid receptor，EcR）、维甲酸X受体（Retinoid X receptor，RXR）和保幼激素酯酶环氧水解酶（Juvenile hormone epoxide hydrolase，JHEH）等酶基因的相对表达量在很大程度上体现罗氏沼虾在不同盐度条件下蜕皮情况的差异，也有利于判断罗氏沼虾在盐度胁迫下的耐受程度（Gao et al.，2020）。目前，关于盐度胁迫对罗氏沼虾的影响主要集中在免疫（姜兰等，2002）、代谢（邹中菊等，2004）、行为与运动学（何竺柳等，2018）、生长和性别分化（邬育龙等，2020）、基因克隆（杨光等，2020）及营养（周剑等，2021）等方面。近年来，研究者的目光更多聚焦于罗氏沼虾蜕皮研究方面，如Kamaruding等（2017）将头胸甲硬度与颗粒结构和性腺发育情况相结合，详细划分罗氏沼虾各个蜕皮时期；卢徐斌等（2018）比较了生长阻滞虾与正常生长虾的蜕皮周期及各蜕皮时期的鉴定方法，结果发现采用第二游泳足置显微镜观测的方法可从生理结构的角度划定蜕皮周期。在能量代谢方面，Lago-Lestón等（2007）分析温度和盐度对凡纳滨对虾幼虾MIH基因表达的影响，结果显示MIH基因在盐度16.0‰时表达量最高，高盐和低盐均对其表达有极显著影响；张俊功等（2020）运用能量收支方程和凯氏定氮法计算罗氏沼虾的蜕壳能、呼吸能和代谢能，并分析其在不同水温及雌雄配比下能量代谢的变化；邱庆庆等（2020）成功克隆了罗氏沼虾的EcR基因，检测到EcR基因在雌虾肝胰腺组织中广泛表达，为研究EcR基因与生长发育调控作用提供理论依据；Kluebsoongnoen等（2020）研究发现维甲酸X受体是诱导母虾卵细胞成功繁殖的重要手段，其通过与RARE结合调控Vg在虾卵巢和肝胰腺中表达。【本研究切入点】目前很多研究主要是针对罗氏沼虾蜕皮或环境因子进行研究，主要集中在免疫营养的研究方面，关于能量代谢方向的研究较少。但在世界范围内广泛存在土地盐碱化、海水倒灌等不良环境因子，导致罗氏沼虾养殖环境面临低盐胁迫的状况，在探究甲壳动物生理生化的同时，应多考虑蜕皮等相关因素，但目前鲜见将理化因子与罗氏沼虾蜕皮时期相结合的研究报道。【拟解决的关键问题】通过人工海水环境模拟盐度胁迫条件，记录罗氏沼虾蜕皮生长等相关的生理指标，对罗氏沼虾的鳃、肝胰腺和肌肉进行能量代谢酶活力测定，并采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测蜕皮相关基因的表达量，探讨罗氏沼虾生长蜕皮与能量代谢酶的相关性，以及不同盐度对罗氏沼虾蜕皮相关基因表达的影响，为罗氏沼虾的集约化养殖提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验虾来源及暂养管理

挑选300只无病、健壮的虾作为试验虾，平均初始湿体质量为4.28±0.53 g/尾，均由上海市申漕特种水产有限公司提供。吸水纸吸干虾体水分，游标卡尺测量虾体长度，电子天平测量虾体质量，试验虾初始平均体质量为4.28±0.53 g，试验前放入室内暂养水泥池（3.50 m×7.15 m×1.10 m）进行一周的暂养，试验全程采用充分曝气的自来水，水温为26℃，pH弱碱性，光照周期为14 L∶10D，连续充气，每天定时（7：00，16：00）投喂饲料两次，饲料投喂量为体重的2%，每天吸取残饵，暂养7 d后转移至蓝色塑料箱（50 cm×60 cm×70 cm）进行正式试验。

1.2 试验设计及盐度驯化

试验共设计5个盐度梯度，分别为0.2‰（对照）、3.0‰、6.0‰、9.0‰和12.0‰。每个梯度设5个重复，将试验虾逐个放入试验箱内，每个虾体用自制的小网兜隔开饲养，以便于观察蜕皮。试验用盐为商用海水晶，以每日提升3.0‰的盐度至目标盐度。将商品温控装置放置于每个试验箱中，初始水温为24℃，将水温升至26℃后维持该温度。每隔2 d换水1次，吸取箱底多余残饵。

试验环境与暂养时的条件保持一致，对每只虾体进行依次编号并设计记录表格，每箱放置12尾试验虾，每隔6 h观察1次，发现蜕皮后及时取出，以每只虾完整经历1次蜕皮开始记录，2次连续的蜕皮之间的时间设为一个完整的蜕皮周期，记录蜕皮周期、蜕皮时间、蜕皮次数及蜕皮后的体质量。此次试验记录3种蜕皮时期，包括蜕皮前期D、蜕皮后期（A、B）和蜕皮间期C）。蜕皮时期判断采用以显微镜观察为主，以外部肠道摄食情况、虾运动活跃、头胸甲的软硬程度情况为辅助判断的方法，显微镜观察时，取游泳足末端置于显微镜下观察。

1.3 样品采集及蜕皮测定

在各盐度组中，当试验虾蜕皮时期分别达到A、B、C、D期时取样，同一盐度组取不同时期试验虾12只。取样时用吸水纸吸干虾体水分，游标卡尺测量虾体长度，电子天平测量虾体质量，在冰盒中迅速解剖，取肝胰腺、胃、肌肉、眼柄和鳃，放入1.5 mL离心管中，立即放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱冷冻保存。罗氏沼虾蜕皮周期为从蜕皮后期A到蜕皮前期D。蜕皮频率（%）=蜕皮总次数/（饲养天数×每箱尾数）；蜕皮增重率（%）=（二龄虾体平均体质量-一龄虾体平均体质量）/一龄虾体平均体质量×100。

1.4 能量代谢相关生化指标测定

测定的生化指标包括PK、SDH及总蛋白含量均采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定，其中，PK用紫外分光光度计进行测定，波长为340 nm。SDH和总蛋白含量用可见光分光光度计进行测定，SDH检测波长600 nm。具体测定方法参考说明进行操作。

PK和SDH活性测定的组织样本为鳃丝、肌肉和肝胰腺。分别取0.1 g上述组织放入匀浆器中，用0.01 mol/L的PBS溶液作为PK和SDH提取液，研磨时加入9倍体积的提取液，在冰上充分研磨，匀浆液倒入1.5 mL离心管中，2500 r/min 4℃离心10 min，取上清放冰上待测。

1.5 RNA提取、反转录及qRT-PCR

利用TRIzol试剂（TaKaRa）分别提取鳃丝、肝胰腺和肌肉的总RNA。然后按照FastKing-RT Supermix逆转录试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］说明，将RNA逆转录合成cDNA第一链。利用Fast-Fire qPCR PreMix SYBR Green［天根生化科技（北京）有限公司］，qRT-PCR检测蜕皮相关基因JHEH、EcR、RXR和MIH的相对表达量，在LightCycler®Real-Time PCR系统上进行。以β-actin为内参基因，每对引物的效率值均为90%～110%。反应体系20.0μL：2×FastFire qPCR PreMix 10.0μL，500 ng/μL cDNA模板0.5μL，10μmol/μL正、反向引物各0.6μL，无核酸酶水8.3μL。扩增程序：95℃180 s；95℃5 s，60℃10 s，72℃15 s，共40个循环。每个基因重复3次，通过熔解曲线分析检测每对引物的特异性。用2-ΔΔCt法计算蜕皮相关基因的相对表达量。

1.6 统计分析

试验数据采用SPSS 25.0进行统计分析，以盐度和蜕皮分期为主要要因素进行Two-ANOVA分析，采用Duncan和LSD法进行多重比较，GraphPad Prism 8.3.0进行作图。

2 结果与分析

2.1 盐度对罗氏沼虾蜕皮周期、每日蜕皮率、蜕皮增重率和体质量的影响

不同盐度下，罗氏沼虾的蜕皮周期、每日蜕皮率、体质量和蜕皮增重率如表1所示。不同盐度对罗氏沼虾的蜕皮周期、每日蜕皮率、体质量和蜕皮增重率有不同程度的影响，其中，蜕皮周期总体上随盐度的增加而逐步延长，以6.0‰盐度组的蜕皮周期最长，显著高于0.2‰和3.0‰盐度组（P＜0.05，下同），但与9.0‰和12.0‰盐度组差异不显著（P＞0.05，下同）；9.0‰盐度组每日蜕皮率达29.30%，显著高于其他盐度组，0.2‰、3.0‰、6.0‰和12.0‰盐度组的每日蜕皮率差异均不显著；罗氏沼虾蜕皮增重率随着盐度的升高呈波动式变化趋势，0.2‰盐度组和3.0‰盐度组的蜕皮增重率显著高于其他盐度组，以6.0‰盐度组的蜕皮增重率最低。

表1 qRT-PCR引物序列信息Table 1 Information of qRT-PCR primers sequences

2.2 盐度对不同蜕皮时期罗氏沼虾肝胰腺中PK和SDH活力的影响

整个试验过程中各个处理组未发现罗氏沼虾死亡或者虾体活动异常的情况。不同盐度下，罗氏沼虾不同蜕皮时期肝胰腺PK和SDH活力如图1所示。在5个盐度下，蜕皮后罗氏沼虾肝胰腺中PK和SDH活力均先升高，在蜕皮后期B达最大值，随着钙化时间的延长，总体呈下降趋势。3.0‰、6.0‰、9.0‰盐度组中，蜕皮后期B的罗氏沼虾肝胰腺PK和SDH活力显著高于蜕皮前期A和蜕皮间期C，但在12.0‰盐度组，罗氏沼虾肝胰腺PK和SDH活力受到明显抑制，各个时期差异不显著。除12.0‰盐度组外，随着盐度的升高，罗氏沼虾肝胰腺中PK和SDH活力总体呈升高趋势。在9.0‰盐度组时，蜕皮后期A的SDH活力和蜕皮后期B的PK活力达最大值。

2.3 盐度对不同蜕皮时期罗氏沼虾鳃丝PK和SDH活力的影响

由图2-A可知，在5个盐度下，罗氏沼虾鳃丝的PK活力随蜕皮后期A到蜕皮前期D整体呈下降趋势，除12.0‰盐度组外，其余盐度组均在蜕皮后期A达最大值，在蜕皮间期C或蜕皮前期D为最小值，显著低于其他蜕皮时期PK活力。在同一蜕皮时期，随着盐度升高，罗氏沼虾鳃丝PK活力总体呈先升高后降低的趋势。由图2-B可看出，在0.2‰盐度组中罗氏沼虾鳃丝的SDH活力在蜕皮后期B达最大值，且显著高于其他盐度组蜕皮后期B的SDH活力；在5个盐度下，罗氏沼虾鳃丝SDH活力随着蜕皮后时间的延长总体呈下降趋势，各盐度组最大值均出现在蜕皮后期A或者蜕皮后期B，高于其他蜕皮时期。除3.0‰和6.0‰盐度组外，在其余的同一盐度组中，随着蜕皮后时间的延长，罗氏沼虾鳃丝SDH活力总体呈先上升后下降趋势。经进一步统计分析发现，盐度和蜕皮时期的双因子交互作用对罗氏沼虾鳃丝的PK和SDH活力影响达极显著（P＜0.01）。

表2 不同盐度条件下罗氏沼虾蜕皮周期、每日蜕皮率和蜕皮增重率Table 2 Molting cycle，daily molting rate and molting weight gain rate of M.rosenbergii under different salinity conditions

2.4 盐度对不同蜕皮时期罗氏沼虾肌肉PK和SDH活力的影响

由图3-A可看出，在3.0‰、6.0‰、9.0‰和12.0‰盐度组中，罗氏沼虾肌肉的PK活力随着蜕皮后时间的延长，总体呈先升高后降低的趋势，且在9.0‰盐度组蜕皮间期C时达最大值，而在0.2‰盐度组下则随着蜕皮时间延长而下降的趋势，在蜕皮间期C和蜕皮前期D达最小值，显著低于同组其他蜕皮时期；在同一蜕皮时期，各盐度组罗氏沼虾肌肉PK活力呈逐渐升高再降低的趋势，在6.0‰盐度组下，蜕皮后期B的PK活力显著高于其他盐度组。由图3-B可看出，除12.0‰盐度组外，其余4个盐度组的罗氏沼虾肌肉SDH活力均随蜕皮时间的延长均呈先上升再下降的趋势，且各盐度组在蜕皮后期B达最大值，但在12.0‰盐度组中，蜕皮前期D的SDH活力突然升高，显著高于同组蜕皮间期C的SDH活力；在同一蜕皮时期，各盐度组SDH活力总体在盐度3.0‰时先下降，然后又上升。经进一步统计分析发现，盐度和蜕皮时期的双因子交互作用罗氏沼虾肌肉的PK和SDH活力影响差异极显著（P＜0.01）。

2.5 盐度对罗氏沼虾肝胰腺MIH和RXR基因表达的影响

由图4-A可知，MIH基因在各盐度组的相对表达量均随蜕皮后时间的延长明显下降，且在0.2‰盐度组和3.0‰盐度组蜕皮后期A和蜕皮后期B的相对表达量显著高于蜕皮间期C（P＜0.05），而在6.0‰和12.0‰盐度组蜕皮后期A和蜕皮后期B的相对表达量极显著高于蜕皮间期C（P＜0.001），在3.0‰和9.0‰盐度组蜕皮前期D的相对表达量极显著低于0.2‰盐度组（P＜0.001）。由图4-B可知，除9.0‰盐度组外，其余盐度组中RXR基因在蜕皮间期C的相对表达量最高，0.2‰和12.0‰盐度组在蜕皮前期、蜕皮后期的RXR基因相对表达量极显著低于蜕皮间期C（P＜0.001）。只在6.0‰和9.0‰盐度组中，蜕皮前期D时RXR基因相对表达量较蜕皮间期C差异不显著。

2.6 盐度对罗氏沼虾鳃丝JHEH和EcR基因表达的影响

由图5-A可知，除12.0‰盐度组外，其余4个盐度组JHEH基因的相对表达量均在蜕皮后期A或蜕皮后期B最高，其中，3.0‰盐度组JHEH基因在蜕皮后期A和蜕皮后期B的相对表达量均极显著高于蜕皮间期C（P＜0.001），其他3个盐度组均在蜕皮后期A或蜕皮后期B极显著高于蜕皮间期C（P＜0.001），但JHEH基因在12.0‰盐度组蜕皮前期D的相对表达量较高，极显著高于蜕皮间期C（P＜0.001）。由图5-B可知，0.2‰盐度组中，EcR基因在蜕皮前期D的相对表达量极显著高于蜕皮间期C（P＜0.001），在蜕皮后期A和蜕皮后期B的相对表达量均极显著低于蜕皮间期C（P＜0.01），但在3.0‰和9.0‰盐度组时，EcR基因在蜕皮后期B的相对表达量极显著高于蜕皮间期C（P＜0.001）。

3 讨论

蜕皮是甲壳动物实现生长的重要方式，其生长为跳跃式生长，每蜕壳一次，个体明显增大，体重也成倍增加（宋宗岩等，2002；徐建荣等，2006）。罗氏沼虾同其他甲壳动物一样，生长呈现出不连续状态，通过每次蜕皮来实现生长（杨明和丁福江，2021）。已有研究证实，盐度环境的变化会影响虾类的生长和生理（Li et al.，2019）。董兰芳等（2021）研究发现，不同盐度对中国鲎幼鲎生长、蜕壳率和增重率产生不同程度的影响，即随盐度升高，这些指标均呈降低的趋势。此外，许多物种均对盐度有一定程度的适应性，但不同物种的盐度适应性和最佳存活性存在明显差异。同一物种不同蜕皮时期对盐度的适应范围也有很大差异，如高盐度27‰和30‰组的克氏原螯虾死亡率显著高于盐度0对照组，且随着盐度升高蜕壳死亡率逐渐下降，在盐度21‰组时达最大值（刘栋梁等，2020）。本研究在养殖过程中发现，罗氏沼虾在不同盐度不同蜕皮时期的采食量存在明显差异，且蜕皮后期B的采食量最大。Juneta-Nor等（2020）研究也发现，蜕皮后期A的平均采食量为（42±1.13）%，蜕皮后期B的平均采食量为（80.2±0.73）%，蜕皮前的平均采食量为（61.1±3.04）%，即蜕皮后期B的采食量最大，与本研究观察的结果一致。在盐度骤变试验中，盐度对南极大磷虾存活率的影响具有显著作用，南极大磷虾存活的适宜盐度为30‰～42‰，以（34±0.4）‰为基础盐度，盐度在特定范围内升高时会增强南极大磷虾的蜕壳率，而随盐度的下降，蜕壳率逐渐降低（赵国庆等，2018）。龙晓文等（2018）研究发现，盐度对脊尾白虾的蜕壳周期有一定影响，12.0‰盐度组的平均蜕壳周期最长（9.57 d），0盐度组的平均蜕壳周期相对较短（8.47 d）。此外，在斑节对虾（Penaeus monodon）（杨其彬等，2008）、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）（路良允等，2012）、青蟹（Scylla serrata）（于忠利等，2010）等甲壳动物也开展了相关的研究，虽然研究结果存在差异，但主要趋势较一致，即不适盐度会阻滞甲壳动物蜕皮的过程，蜕皮周期相对延长，增重率和特定生长率下降。本研究发现，罗氏沼虾的蜕皮周期总体随盐度的升高而逐渐延长，在盐度6.0‰条件下，蜕皮周期最长；随着盐度的升高，罗氏沼虾的蜕皮增重率整体呈下降趋势，进一步验证了上述研究的结论。

能量代谢酶是甲壳动物调控能量代谢过程重要的蛋白质物质，其活力受盐度的影响，在不适盐度时其活力大大下降。糖代谢是动物能量代谢的一个重要过程，葡萄糖首先被糖酵解为丙酮酸，为机体提供能量。PK是糖酵解过程中重要的变构调节酶，也是重要的限速酶，PK活力能反映糖酵解的水平（戴超等，2013）。海水养殖条件下，凡纳滨对虾在蜕皮后期A和蜕皮后期B的PK活力为150.67和164.5 U/g prot，而在蜕皮间期C的活力下降，在蜕皮前期D1和D2达最高，而在淡水条件下PK活力在蜕皮后期B最高（丁森，2010）。本研究发现，低盐度（0.2‰、3.0‰、6.0‰）组肝胰腺、鳃丝和肌肉的PK活力在蜕皮后不断升高，在蜕皮后期A或B时，其PK活力最高，进一步验证了上述研究的结论。可见，在低盐度的情况下，糖酵解受到低盐度刺激后速率加快，进而促进了ATP生成和NAD＋再生，而在高盐度情况下，PK活力下降，糖酵解受到抑制。随盐度的骤降和胁迫时间的延长，云纹石斑鱼鳃丝的SDH活力在低盐度组均出现先升高后降低的趋势，在第7 d SDH活力随盐度的降低而降低（施兆鸿等，2017）。盐度升高使加州扁鸟蛤的SDH活力呈下降趋势（聂鸿涛等，2018）。本研究结果显示，罗氏沼虾肝胰腺的SDH活力随着盐度的升高呈先升高后降低的趋势，不适盐度抑制了其肝胰腺的SDH活力，与上述研究结果相似。而周小愿等（2009）研究发现，罗氏沼虾肌肉SDH活力在盐度33‰、63‰、93‰条件下，随着蜕皮时间增加而先下降后上升的趋势，说明肌肉的三羧酸循环作用不断加强，弥补了在蜕皮后期时糖酵解速率的加大而导致能量不足的原因。表明罗氏沼虾肌肉SDH活力符合变温动物体内的补偿机制，当外界环境变化时，动物体通过调整有氧代谢来适应环境变化。

由于孙海峰（2017）研究发现罗氏沼虾蜕皮相关基因在肝胰腺和鳃丝中皆有表达，因此本研究选取肝胰腺和鳃丝组织作为采样对象。MIH是X器官-窦腺复合体分泌的神经肽类激素家族中的一种，EcR在MIH基因上游启动子区域存在转录调节位点，说明MIH基因的表达水平受蜕皮激素的影响（Lu et al.，2000）。虽然本研究发现MIH基因在肝胰腺中的相对表达量随着蜕皮后时间的延长而降低，但各盐度组之间无显著差异，说明盐度因子不会影响MIH基因在各个时期的表达，且EcR基因的相对表达量在蜕皮前期较高，说明了蜕皮激素受体反向影响了MIH基因的表达水平。在生长阻滞虾EcR基因的相对表达量低于正常虾，生长阻滞虾MIH基因的相对表达量显著高于正常虾（孙海峰，2017），与本研究结论相符。JHEH和RXR对甲壳动物的生长发育发挥关键作用（Bainbrideg，1984）。本研究发现，罗氏沼虾肝胰腺RXR基因的相对表达量在蜕皮间期C最高，鳃丝JHEH基因的相对表达量在蜕皮后期最高，说明罗氏沼虾在蜕皮后及蜕皮间期是生长最快的阶段，进一步验证了上述研究的结论。此外，本研究结果显示，当水体盐度不断升高时，对罗氏沼虾的蜕皮生理生化指标、能量代谢酶活力及蜕皮相关基因表达量均有较大影响，且均趋于对蜕皮不利的结果，当水体盐度在12.0‰以上时会造成虾体蜕皮困难，最终导致死亡的情况。

4 结论

低盐度（0.2‰～9.0‰）对罗氏沼虾的生长蜕皮有较大影响，导致蜕皮增重率下降，蜕皮周期变长，对生产实践产生负面影响，还可使罗氏沼虾肌肉和肝胰腺中的PK和SDH活力升高，从而促使肝胰腺和肌肉中的糖酵解速率加快，三羧酸循环作用加强，但在高盐度（12.0‰）条件下受到抑制。盐度胁迫下，MIH基因上调表达、EcR基因下调表达会引发蜕皮前期D时间延迟，蜕皮困难，致使JHEH和RXR基因表达下调，是导致罗氏沼虾生长缓慢的主要原因。罗氏沼虾养殖适宜的水体盐度为0.2‰～3.0‰。