1株桉大毛虫病原真菌的分离鉴定及其寄主范围测定

2022-11-09樊春丽罗来凤温文照韦文飞韦继光

南方农业学报 2022年8期

樊春丽，罗来凤，温文照，韦文飞，韦继光*

（1广西大学农学院，广西南宁 530004；2广西国有钦廉林场，广西钦州 535099；3广西国有维都林场，广西来宾 546100）

0 引言

【研究意义】近年来，农林害虫的发生程度日益加剧，发生范围不断扩大，严重影响我国农业和林业的发展（刘冬等，2014）。目前对于害虫的防治以化学防治为主，但化学防治存在诸如引起昆虫体内产生抗性、昆虫再猖獗以及农药残留从而污染环境等问题，化学农药的不当使用导致害虫快速产生抗药性，而害虫再猖獗通常相伴抗药性而生，且抗药性越严重农药残留越多，给环境带来巨大压力。要解决这些问题，化学农药的使用必须合理得当；此外，利用生物杀虫剂对害虫进行防治也是缓解化学农药对环境破坏的一项有力举措。生物杀虫剂来源于真菌、细菌、病毒及其活性代谢物（Bode，2009；Lacey et al.，2015）。其中虫生真菌（Entomophagous fungus）是一种重要的生物杀虫剂，其能侵入昆虫体内寄生从而使昆虫发病致死。从目前的形势来看，虫生真菌因具有生产方便、成本低廉、寄主范围广、害虫不产生抗药性和保护环境等优点在未来对害虫的防治中具有广阔的应用前景（耿敬可等，2020）。【前人研究进展】被昆虫病原真菌感染是致使自然界中昆虫死亡的原因之一。随着时间的推移，虫生真菌不断地被人们发现，种类也越来越多。据不完全统计，世界上被记载的虫生真菌有100属1000多种（王记祥和马良进，2009；刘春来，2017）。19世纪60年代以来开发了大量的真菌杀虫剂和杀螨剂，至少有12种真菌被用作真菌杀虫剂和杀螨剂的活性剂，其中最常见的有白僵菌（Beauveria bassiana）、绿僵菌（Metarhizium anisopliae）、玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea）和布氏白僵菌（Beauveria brongniartii）（Faria and Wraight，2007）。棒束孢属虫生真菌逐渐被人们发现并被运用于生物防治中，其中，常见的棒束孢属有粉棒束（I.farinosa）、玫烟色棒束孢（I.fumosorosea）、细脚棒束孢（I.tenuipes）和环链棒束孢（I.cateniannulata）等。爪哇棒束孢（I.javanica）是棒束孢属中一种重要的昆虫病原真菌，但目前关于该菌的报道还相对较少，且其已明确的寄主范围相对较小。展茂魁等（2012）将一株从茶小绿叶蝉上分离得到的爪哇棒束孢接种茶小绿叶蝉，其毒力相较于从其他叶蝉上分离得到的活性较高的2株球孢白僵菌而言分别高2.33～7.26倍和6.08～27.62倍；陈名等（2014）将一株分离自小绿叶蝉的爪哇棒束孢菌株用0.1%吐温-80水溶液配成1×108个孢子/mL，采用Potter喷雾塔喷雾接种假眼小绿叶蝉若虫，12 d后假眼小绿叶蝉若虫死亡率达100%；邓嘉茹等（2020）从一头自然感病的埃及吹绵蚧中分离得到1株爪哇棒束孢IJID003，当分生孢子浓度为1×108个/mL时对埃及吹绵蚧2龄若虫、3龄若虫和雌成虫的半数致死时间（LT50）分别为1.89、2.29和2.31 d；斜纹夜蛾［Spodoptera litura（Fabricius）］幼虫取食经1.00×107孢子/mL爪哇棒束孢浸泡处理的甘蓝叶片48 h后死亡率达86.96%（苏湘宁等，2021）；张志春等（2020）将爪哇棒束孢孢子液均匀喷雾于带有非洲菊烟粉虱的黄瓜叶片正反面，7 d后非洲菊烟粉虱成虫的死亡率达100%；爪哇棒束孢对水稻害虫褐飞虱有很高的致病力（Zhao et al.，2020）。有研究表明，爪哇棒束孢在对害虫产生致病力的同时，还可抑制植物病害的发生（Kang et al.，2018；Lee et al.，2019；Lee and Kim，2019）。【本研究切入点】当前农林害虫频繁发生，以菌治虫是对害虫进行防治的重要手段，但目前高毒力且寄主范围广的虫生真菌种类较少。【拟解决的关键问题】采用常规组织分离法从自然感染死亡的桉大毛虫上分离病原菌，经致病性测定后，通过菌株形态学特征观察和rDNA-ITS、EF1-α、β-tublin基因测序相结合对病原菌进行鉴定，并在此基础上进一步测定病原菌的生物学特性、寄主范围、对4龄东亚飞蝗若虫、红火蚁和4龄马尾松毛虫幼虫的毒力及对桉树林害虫的防治效果，以期为该病原菌在害虫生物防治上的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病样从广西国有钦廉林场桉树上采集被真菌感染的桉大毛虫僵虫典型样品，将其保存于试管并带回实验室进行拍照后保存，备用。

1.1.2 培养基PDA培养基：马铃薯（去皮）200.00 g、葡萄糖20.00 g、琼脂20.00 g、蒸馏水1000 mL；查氏培养基：蔗糖30.00 g、NaNO33.00 g、K2HPO41.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、KCl 0.50 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、琼脂20.00 g、蒸馏水1000 mL。

1.1.3 供试害虫桉大毛虫［Suana divisa（Moore）］幼虫采集于广西国有维都林场；东亚飞蝗［Locusta migratoria manilensis（Meyen）］虫卵来源于云南楚雄，在养虫室内以玉米叶片喂养，饲养至所需虫态；红火蚁［Solenopsis invicta（Buren）］于广西南宁市邕江边捕捉，捕获后挑出大小一致、活性较强的虫体进行试验；马尾松毛虫［Dendrolimus punctatus（Walker）］由广西林业科学研究院提供。用于病原菌寄主范围测定的4目16种害虫：桉蝙蛾［Endoclita signifer（Walker）］、马尾松毛虫、草地贪夜蛾［Spodoptera frugiperda（Smith）］、绿刺蛾（Parasasp.）、绿黄枯叶蛾［Trabala vishnou（Lefebure）］、桉袋蛾［Acanthopsyche subferalbata（Hampson）］、油桐尺蛾［Buzura suppressatia（Guenee）］、橙带蓝尺蛾［Milionia basalis（Walker）］、小用克尺蛾［Jankowskia fuscaria（Leech）］、绿脉锦斑蛾［Chalcosia pictinicornis auxo（Linnaeus）］、樟巢螟［Orthaga achatina（Butler）］、红火蚁、家白蚁［Coptotermes formosanus（Shiraki）］、东亚飞蝗、螽斯属（Tettigoniasp.）和榕透翅毒蛾［Perina nuda（Fabricius）］，其中，桉蝙蛾、绿刺蛾、绿黄枯叶蛾、桉袋蛾、油桐尺蛾、小用克尺蛾和螽斯采集于广西国有维都林场，马尾松毛虫由广西林业科学研究院提供，草地贪夜蛾和榕透翅毒蛾由广西大学农学院应用昆虫研究所提供，橙带蓝尺蛾采集于广西拉浪林场，绿脉锦斑蛾和樟巢螟采集于广西钦廉林场，红火蚁捕捉于广西南宁市邕江边，家白蚁由广西南宁天鹰有害生物防治公司提供，东亚飞蝗虫卵来源于云南楚雄。

1.2 病原菌分离

在超净台中将死虫放入盛有75%酒精的烧杯中浸泡消毒30 s，再转移至5%次氯酸钠中浸泡消毒3 min，将虫体取出依次放入3瓶无菌水中冲洗后置于灭菌滤纸上晾干表面水分，把虫体解剖成小块，然后将组织块放置在含有50μg/mL链霉素的PDA培养基上，每皿放5块，置于25℃下培养，待其长出菌丝后用挑针挑取菌丝到PDA培养基上进行纯化培养。纯化培养重复3次，单孢分离选出长势较好的菌株并接种于PDA斜面培养基，置于4℃冰箱保存备用。

1.3 病原菌致病性测定

将病原菌接于PDA培养基上培养，待其产孢后用0.05%吐温-80配制成1×108孢子/mL接种桉大毛虫，对照组用0.05%吐温-80处理，置于26 °C培养箱中光、暗各12 h培养，喂以新鲜的桉树叶片。定期观察桉大毛虫感染死亡情况。

1.4 病原菌鉴定

1.4.1 形态学鉴定挑取纯化培养的菌株菌落边缘菌丝转接至PDA培养基中央，于26℃恒温培养箱中培养，观察菌落形态、颜色、菌丝疏密程度等形态特征，并挑取菌丝制成玻片，置于光学显微镜和蔡司显微镜下观察菌丝和分生孢子形态。

1.4.2 分子鉴定根据NuClean Plant Genomic DNA Kit试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）说明书进行病原菌DNA提取，以提取的DNA为模板，选择目的基因核糖体转录间隔序列（ITS）、延伸因子-α（EF1-α）和β-微管蛋白基因（β-tubulin）进行扩增与测序。扩增体系25.000μL：10×PCR Buffer 2.500μL，Taq酶0.125μL，dNTP 0.500μL，上、下游引物各1.000μL，DNA模板1.000μL，ddH2O 18.875 μL。ITS、β-tubulin的PCR反应程序：95℃预变性3 min；95℃30 s、52℃30 s、72℃1 min，进行35个循环；72℃延伸10 min。EF1-α的PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃30 s、55℃45 s、72℃90 s，进行35个循环；72 °C延伸7 min。扩增完成后，样品送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。用Bioedit v7.0.9和DNAman v6对获得的测序结果进行处理，并在GenBank数据库进行BLAST比对，下载可信度高的相关序列，利用MEGA 7.0采用邻接法（Neighbor-joining）构建系统发育进化树。构建发育树时进行自举检验，重复抽样1000次。

1.5 病原菌生物学特性测定

1.5.1 不同光照条件对病原菌菌丝生长和产孢的影响在超净工作台上，用直径为6 mm的打孔器沿着在PDA培养皿上活化培养6 d的病原菌菌落边缘打孔，用镊子将菌丝块菌面朝下放置于新的PDA培养皿中央，用封口膜封口后分别置于全光照（24 L∶0 D）、光暗交替（12 L∶12 D）和全黑暗（0 L∶24 D）3种光周期培养箱中培养，培养温度为25 °C。每处理3个重复。于第9 d采用十字交叉法测量菌落直径，并用0.05%吐温-80将孢子洗下，摇匀后用血球计数板测定产孢量。

1.5.2 不同温度对病原菌菌丝生长和产孢的影响在PDA培养基中心移入直径为6 mm的病原菌活化菌落边缘的菌丝块，封口后分别置于5、10、15、20、24、26、28、30和35℃的培养箱中培养。每处理3个重复。菌落直径和产孢量测定同1.5.1。

1.5.3 不同pH对病原菌菌丝生长和产孢的影响将新鲜的PDA培养基高压灭菌后用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH溶液在无菌条件下将培养基的pH调节至4、5、6、7、8、9、10和11共8个酸碱度，倒好PDA培养基后将直径为6 mm的菌块接种于不同pH的PDA培养基中央，封口后置于25℃培养箱中培养。每个酸碱度为一个处理，每处理3个重复。菌落直径和产孢量测定同1.5.1。

1.5.4 不同碳、氮源对病原菌菌丝生长和产孢的影响采用查氏培养基为基础培养基，以蔗糖为碳源，测定酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、NaNO3、尿素、甘氨酸对菌丝生长和产孢的影响；以NaNO3为氮源，测定葡萄糖、果糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、淀粉对菌丝生长和产孢的影响。以不加氮源及不加碳源为对照，每处理3次重复。于第14 d采用十字交叉法测量菌落直径，并用0.05%吐温-80将孢子洗下来，摇匀后用血球计数板测定产孢量。

1.6 病原菌寄主范围测定

用0.05%吐温-80将病原菌孢子配制成1×108孢子/mL孢子悬浮液接种4目16种害虫，每种虫设3个重复，每个重复虫口数不少于10头。对照喷洒0.05%吐温-80溶液。接种后置于25 °C培养箱中光暗各12 h培养，并喂以相应的食物，观察感染情况。对于被感染死亡的昆虫，及时进行分离，观察分离到的菌株与原接种菌株的菌落形态、分生孢子形态是否一致。

1.7 病原菌对东亚飞蝗、红火蚁和松毛虫的毒力测定

用0.05%吐温-80把在PDA培养基上活化培养14 d的病原菌孢子洗脱，得到孢子母液，将母液配成1×105、1×106、1×107和1×108孢子/mL共4个浓度梯度的孢子悬浮液，每个浓度为一个处理，每处理3个重复，每重复15头东亚飞蝗4龄若虫和30头红火蚁，采用喷洒法将每个浓度的孢子悬浮液喷至东亚飞蝗和红火蚁上，而后将东亚飞蝗和红火蚁放入养虫皿中，东亚飞蝗以新鲜玉米叶喂养，红火蚁以新鲜玉米粒喂养，置于25 °C培养箱内光暗各12 h培养，对照组的东亚飞蝗和红火蚁喷洒0.05%吐温-80水溶液。马尾松毛虫则采用浸泡法，将4龄马尾松毛虫幼虫用1×106、1×107和1×108孢子/mL的孢子悬浮液浸泡5 s，将浸泡接种后的马尾松毛虫放入培养皿中，以新鲜松针喂养，置于25 °C培养箱内光暗各12 h培养，每处理3个重复，每重复15头松毛虫，对照组的松毛虫则用0.05%吐温-80水溶液浸泡5 s。每天定时观察、记录3种昆虫的死亡情况，发现死虫则将其挑出，放至带有灭菌滤纸的玻璃培养皿中加无菌水保湿培养，观察其是否长出菌丝。

试验数据利用SPSS 19.0进行统计分析，运用Duncan’s新复极差法进行差异显著性分析。

1.8 大田防治试验

2020年在广西国有维都林场开展桉树林害虫防治试验，面积约133.33 ha，每公顷用病原菌生产的菌粉15 kg，7月25日—8月2日喷菌粉，其中设13.33 ha的对照区，8月16—17日进行防治效果调查。2021年在广西国有维都林场平塘分场开展防治试验，面积40.00 ha，每公顷用菌粉15 kg，10月12—13日喷粉，其中设6.67 ha的对照区，10月22日进行防治效果调查。供试桉树林均为一年生桉树，在每个防治区和对照区随机调查30株以上，主要调查桉树鳞翅目害虫、蝗虫、螽斯、角蝉和广翅蜡蝉等肉眼可见的害虫。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离及致病性测定结果

从罹病桉大毛虫上分离到1株真菌，命名为DMC01，将纯化后得到的菌株配制成1×108孢子/mL孢子液接种桉大毛虫，4 d后处理组桉大毛虫开始出现死亡并且虫体上长出白色菌丝，对照组的桉大毛虫无感染死亡情况发生。从感染死亡的僵虫分离得到的分离株与原接种菌株的菌落形态、分生孢子形态完全一致，证明分离获得的菌株是罹病桉大毛虫的致病菌。

2.2 病原菌形态学观察结果

从图1可看出，菌株DMC01在PDA培养基上菌落为绒毛状圆形，可形成沟壑状的同心轮纹，待其产孢后孢子层为浅紫灰色，菌落背面为淡黄色。菌丝无色透明，分生孢子梗上产生轮生状瓶梗，瓶梗基部椭圆形膨大，向上逐渐变细；分生孢子在瓶梗上生长形成孢子链，分生孢子呈透明光滑的长椭圆形，大小为3.2～6.5μm×1.3～2.0μm（n=50）。参考相关文献（代永东等，2016），菌株DMC01与棒束孢属的形态特征相符，且分生孢子大小与爪哇棒束孢基本一致，初步鉴定该菌株属于爪哇棒束孢。

2.3 病原菌分子鉴定结果

利用真菌ITS引物ITS1和ITS4、EF1-α引物EF1-526F和EF1-1567R、TUB引物Bt2a和Bt2b对病原菌DMC01的ITS、EF1-α和β-tubulin进行扩增，扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，登录NCBI对测得的序列分别进行BLAST比对，结果显示菌株DMC01的rDNA-ITS、EF1-α和β-tubulin（GenBank登录号分别为OM131696、OM177062和OM177063）与I.javanicaCHE-CNRCB 305和I.javanicaCBS 134.22的相似性均达99%以上，基于rDNA-ITS、EF1-α和β-tubulin序列联合构建的系统发育进化树（图2）也显示，菌株DMC01与I.javanicaCHE-CNRCB 305和I.javanicaCBS 134.22在同一分支，其中I.javanicaCBS 134.22是爪哇棒束孢的模式菌株。结合菌株DMC01形态和分子鉴定结果，可确定菌株DMC01为爪哇棒束孢（I.javanic）。

2.4 菌株DMC01的生物学特性测定结果

2.4.1 不同光照条件对菌株DMC01菌丝生长和产孢的影响从表1可看出，全光照和光暗交替培养条件下菌株DMC01菌丝生长较好，菌落直径差异不显著（P＞0.05，下同），且二者菌落直径均显著高于全黑暗处理（P＜0.05，下同）；全光照条件下产孢量最多，达1.82×109个/皿，比全黑暗条件下的产孢量高6.5倍，显著高于光暗交替和全黑暗条件下培养的产孢量。

表1 不同光照条件对菌株DMC01菌丝生长和产孢的影响Table 1 Effects of different light conditions on mycelial growth and sporulation of strain DMC01

2.4.2 不同温度对菌株DMC01菌丝生长和产孢的影响菌株DMC01在15～30℃条件下均可生长及产孢，但菌落直径和产孢量随着温度的改变而有所差异（表2）。综合菌落直径和产孢量，26℃条件下最有利于菌株DMC01菌丝生长和产孢，菌丝直径为4.10 cm，产孢量为1.42×109个/皿，显著高于其他温度条件下的产孢量；24和28 °C条件下菌落直径分别为3.93和3.80 cm，产孢量分别为0.97×109和0.99×109个/皿，二者间菌落直径和产孢量差异均不显著；35℃条件下菌株不生长，5和10℃条件下菌丝生长极慢且不产孢。

表2 不同温度对菌株DMC01菌丝生长和产孢的影响Table 2 Effects of different temperatures on mycelial growth and sporulation of strain DMC01

2.4.3 不同pH对菌株DMC01菌丝生长和产孢的影响由表3可知，菌株DMC01在pH 4～10条件下均可生长及产孢，其中，pH 7和pH 8时菌丝生长最快，菌落直径分别为4.58和4.65 cm，两者间菌落直径差异不显著且显著大于其他pH处理；pH 6和pH 7时产孢量最多，产孢量分别达2.15×109和2.03×109个/皿，两者间产孢量差异不显著且显著大于其他pH处理；pH 11时菌株不生长，菌落直径和产孢量均为0。因此，pH 7时既有利于菌丝生长，又有利于孢子的产生。

表3 不同pH对菌株DMC01菌丝生长和产孢的影响Table 3 Effects of different pH values on mycelial growth and sporulation of strain DMC01

2.4.4 不同碳、氮源对菌株DMC01菌丝生长和产孢的影响由表4可知，菌株DMC01以淀粉为碳源时最有利于菌丝生长，培养第14 d时菌落直径达5.67 cm，其次是蔗糖和甘露醇，菌落直径分别为5.60和5.53 cm；最有利于菌株产孢的碳源是蔗糖，产孢量为0.54×109个/皿，显著高于其他碳源的产孢量；不加碳源的对照菌丝稀少而透明，不产孢。由表5可知，以酵母浸粉和牛肉膏为氮源时最有利于菌株DMC01菌丝生长和产孢，且二者间无显著差异，菌株的菌落直径分别为6.07和5.93 cm，产孢量分别为3.71×109和4.01×109个/皿；供试所有氮源均适宜菌株DMC01菌丝生长，但产孢量存在较大差异，其中以牛肉膏作为氮源的产孢量是以甘氨酸作为氮源的产孢量的6.68倍；不加氮源的对照菌丝稀少而透明，不产孢。

表4 不同碳源对菌株DMC01菌丝生长和产孢的影响Table 4 Effects of different carbon sources on mycelial growth and sporulation of strain DMC01

表5 不同氮源对菌株DMC01菌丝生长和产孢的影响Table 5 Effects of different nitrogen sources on mycelial growth and sporulation of strain DMC01

2.5 菌株DMC01寄主范围测定结果

用1×108孢子/mL孢子悬浮液对4目16种害虫进行接种试验，结果（图3）显示，鳞翅目的马尾松毛虫、草地贪夜蛾、绿刺蛾、绿黄枯叶蛾、桉袋蛾、油桐尺蛾、橙带蓝尺蛾、小用克尺蛾、绿脉锦斑蛾和樟巢螟，膜翅目的红火蚁，等翅目的家白蚁及直翅目的东亚飞蝗和螽斯共4目14种害虫出现感染死亡情况，并均能从僵虫中分离到与菌株DMC01菌落形态和分生孢子形态一致的病原菌；被感染的昆虫体表布满白色菌丝，随后产生大量孢子。供试16种害虫中仅鳞翅目的桉蝙蛾和榕透翅毒蛾未被感染。

2.6 菌株DMC01对东亚飞蝗、红火蚁和马尾松毛虫的毒力测定结果

由表6和表7可知，菌株DMC01对4龄东亚飞蝗、红火蚁和4龄马尾松毛虫均具有高致病力，随着菌株DMC01孢子浓度的升高及处理时间的推移，东亚飞蝗、红火蚁和马尾松毛虫的校正死亡率均逐渐升高。在处理后第4 d，1×105和1×106孢子/mL处理下的东亚飞蝗和红火蚁校正死亡率均较低，在1×108孢子/mL处理下第6 d东亚飞蝗和红火蚁的校正死亡率均达100.00%；处理8 d后，1×105和1×106孢子/mL处理的东亚飞蝗校正死亡率分别为69.05%和95.24%，其余处理均达100.00%；高浓度孢子液处理下，红火蚁在第4 d的校正死亡率开始升高，1×107孢子/mL处理下第8 d校正死亡率达100.00%。1×106孢子/mL处理15 d后的马尾松毛虫的校正死亡率依然较低，仅为27.91%，但在1×108孢子/mL浓度处理下第10 d的校正死亡率达100.00%。

表6 菌株DMC01对东亚飞蝗4龄若虫和红火蚁的毒力Table 6 Virulence of strain DMC01 to the 4th instar larvae of L.migratoria manilensis（Meyen）and S.invicta（Buren）

表7 菌株DMC01对马尾松毛虫4龄幼虫的毒力Table 7 Virulence of strain DMC01 to the 4th instar larvae of D.punctatus（Walker）

2.7 大田防治试验结果

大田防治结果（表8）显示，2020年菌株DMC01菌粉对桉树林间所有害虫的平均防效为51.9%，对桉树鳞翅目害虫的平均防效达60.9%；2021年对桉树林间害虫的平均防效为79.1%，对桉树林间鳞翅目害虫的平均防效达81.4%。从防治效果看，2021年的防效优于2020年；同时，大田防治后从白蛾蜡蝉（同翅目）死虫中分离到与菌株DMC01形态一致的菌株，证明菌株DMC01孢子粉也能感染白蛾蜡蝉。

表8 菌株DMC01对桉树害虫的防治效果（%）Table 8 Control effect of strain DMC01 on eucalyptus pests（%）

3 讨论

棒束孢属曾在1974年被Samson并入拟青霉属（Sampson，1975），直至2005年才被Hodge等（2005）提议重新恢复为棒束孢属。在菌丝端部或短侧枝上轮生瓶状或近球形的分生孢子梗、分生孢子为单孢链状等是棒束孢属的主要特征（黄勃等，2008）。本研究中的菌株DMC01，从形态学上观察，其符合棒束孢属爪哇棒束孢的特征，但由于棒束孢属中存在许多形态相似的种，为保证鉴定结果的准确性，本研究对该菌株的ITS、β-tubulin和EF1-α序列进行测定，采用3种序列联合构建系统发育进化树，结果进一步证实菌株DMC01为爪哇棒束孢。

生物学特性是当前对虫生真菌的研究方向之一（芦俊佳等，2018；雷研圆等，2020），只有在了解其生物学特性后，才能在培养过程中达到最佳产孢量。在棒束孢属中，有学者测定了粉棒束孢和玫烟色棒束孢的生物学特性（雷妍圆等，2010；刘飞，2018），但目前尚未发现关于爪哇棒束孢生物学特性测定的报道。不同的虫生真菌种类其生物学特性会有一定差异，而大多数虫生真菌的最佳生长和产孢温度为25和26℃，pH在7左右，与本研究中爪哇棒束孢菌株DMC01的最佳生长和产孢温度及pH基本一致。菌株DMC01最佳生长和产孢的光照条件为全光照条件，与黄鹏等（2018）及赵鹏飞等（2019）对金龟子绿僵菌和曲霉的研究结果存在差异，而与张仙红等（2006）对玫烟色拟青霉的研究结果一致。最有利于菌株DMC01生长的碳、氮源分别为淀粉和酵母浸粉，最有利于产孢的碳、氮源分别为蔗糖和牛肉膏，与张仙红等（2006）对玫烟色拟青霉及张亚波等（2015）对绿僵菌的研究结果有所差异。可见，不同的虫生真菌的生物学特性存在差异。本研究对爪哇棒束孢菌株DMC01进行生物学特性测定，有利于进一步加深对爪哇棒束孢的认识，从而为筛选最佳培养条件和大规模生产孢子粉提供理论基础。

有关爪哇棒束孢寄主的报道相对较少，且大部分是在鳞翅目昆虫上记载（Shimazu and Takatsuka，2010）。目前已报道的爪哇棒束孢寄主有鳞翅目的舞毒蛾（Shimazu and Takatsuka，2010）、美国白蛾（Wang et al.，2020）、斜纹夜蛾（苏湘宁等，2021），同翅目的假眼小绿叶蝉（陈名等，2014）、埃及吹绵蚧（邓嘉茹等，2020；邓嘉茹等，2021）、扶桑绵粉蚧（邓嘉茹等，2021）、柑橘木虱（Qasim et al.，2018），缨翅目的蓟马（Thrips）（范咏梅等，2021），半翅目的蚜虫（Lee et al.，2019；Bocco et al.，2021）、烟粉虱（张志春等，2020）、褐飞虱（Zhao et al.，2020），鞘翅目的黄曲条跳甲（陈纬等，2021）等。本研究用爪哇棒束孢菌株DMC01的孢子液室内接种多种害虫，结合大田防治试验发现其能感染马尾松毛虫、草地贪夜蛾、绿刺蛾、绿黄枯叶蛾、橙带蓝尺蛾、小用克尺蛾、油桐尺蛾、桉袋蛾、绿脉锦斑蛾、樟巢螟、白蛾蜡蝉、东亚飞蝗、螽斯、红火蚁、家白蚁等5目15种害虫，且均能从被感染后的虫体上分离到与菌株DMC01菌落和分生孢子形态一致的病原菌。目前尚未见爪哇棒束孢对上述害虫寄生的相关报道，因此，本研究在前人研究基础上加深了对爪哇棒束孢寄主范围的认识，不仅增加了寄生鳞翅目和同翅目害虫种类，同时还增加了直翅目、膜翅目和等翅目的寄主，这为爪哇棒束孢的利用提供了更广阔的前景。同种虫生真菌其来源不同，寄主范围也可能存在差异，未来在继续对菌株DMC01进行寄主范围测定的同时，还可用其对前人已测定过的寄主进行验证。

较早被人们发现并运用于生物防治上的重要虫生真菌资源有白僵菌和绿僵菌等，目前包括东亚飞蝗、红火蚁和马尾松毛虫在内的许多害虫其主要病原真菌以白僵菌和绿僵菌为主。侯颖等（2015）从一头黑蚱蝉僵虫中分离得到1株绿僵菌菌株Ma121，将该菌株以1×107～1×108孢子/mL处理东亚飞蝗，其校正死亡率均在90%以上；王义勋等（2016）从不同僵虫上分离获得20株白僵菌菌株后均以1×107孢子/mL浓度处理马尾松毛虫，其中，接种B-2、B-14和B-19菌株11 d后校正死亡率达100%；吴志鹏和童应华（2020）将11株球孢白僵菌和9株金龟子绿僵菌均以1×107孢子/mL浓度处理红火蚁，10 d后白僵菌和绿僵菌处理对其校正死亡率分别为（6.47±0.98）%～（67.14±0.22）%和（35.13±1.25）%～（81.93±0.94）%。本研究中以1×108孢子/mL浓度的菌株DMC01孢子接种4龄东亚飞蝗、红火蚁和4龄马尾松毛虫，其校正死亡率在接种6～10 d后均达100.00%，证明爪哇棒束孢菌株DMC01具有高毒力，因此可作为优良菌株对东亚飞蝗、红火蚁和马尾松毛虫等害虫进行防治，今后还可进一步开展菌株DMC01对其他害虫的毒力测定，为其他害虫的防治提供理论基础。

广西桉树种植面积达200万ha，是我国桉树种植面积最大的省份。广西桉树林害虫以鳞翅目害虫如桉小卷蛾、油桐尺蠖、桉袋蛾和小用克尺蛾等为主（刘秀媚和闪瑶，2020），目前对桉树害虫防治主要以化学防治为主，利用生物菌粉对桉树害虫进行防治的相关报道较少。郑凌生（2010）用白僵菌粉炮（15、30和60个/ha）对桉树油桐尺蛾进行防治，对应的校正虫口减退率分别为68.38%、71.18%和67.50%。本研究将生产得到的爪哇棒束孢菌株DMC01菌粉初步应用于桉树林害虫进行野外防治试验，2020年平均防效为51.9%，2021年平均防效为79.1%，在取得较好防治效果的同时不污染环境，不易使害虫产生抗性，且能达到控制有害生物的效果，爪哇棒束孢具有广阔的应用前景。

爪哇棒束孢菌株DMC01是一株极具生物防治潜力的虫生真菌，其寄主范围还有待进一步拓展。真菌制剂除要求产孢量大外，常温货架期应达12～18个月（Sanyang et al.，2000），同时满足这2个条件才能更有效地开展野外防治试验，因此，下一步的研究可围绕菌粉的货架期进行。此外，还可开展爪哇棒束孢菌株DMC01的致病机理研究，以丰富其致病性的理论基础和实践应用。