指数施肥对云曼红豆杉幼苗活性成分10-DAB及养分累积的影响

孙志鹏，王 刚，武华卫，贾 晨，蒲尚饶，罗建勋*

(1 四川省林业科学研究院，森林和湿地生态恢复与保育四川省重点实验室，成都 610081；2 国家林业草原红豆杉西南工程技术研究中心，成都 611800)

云曼红豆杉(Taxusmadia×Taxusyunnanensis‘Yunman’)是人工选育出的红豆杉优良品种(川R-SV-TMTY-008-2018)，枝叶中10-DAB含量(人工半合成紫杉醇的重要原料)可达0.3%以上。因具有较高的药用价值，近年来对云曼红豆杉苗木的需求也不断加大，大力育苗营建云曼红豆杉药用原料林就成为缓解10-DAB原料短缺和满足市场需求的有效途径。营造高质量云曼红豆杉药用原料林的基础是培育优良的云曼红豆杉苗木。研究表明，矿质营养的供给是提高苗木质量，培育优质壮苗的重要手段[1-3]。目前，云曼红豆杉苗木营养供给常采用施入基肥或追肥的方式，这不仅不能满足苗木在各生长时期的养分需求，还会因不符合养分需求规律而造成大量浪费。因此，选取合理的施肥方式提高肥料利用效率和提升苗木规格十分必要[4-5]。

Ingestad等[6]根据“指数养分承载理论”提出了指数施肥的技术，它与传统施肥方法相比不仅能满足各生长阶段(特别是速生期)养分需求，促进苗木生长，还能有效增加苗木体内养分储备，增强抗逆性，提升苗木质量[7-9]。目前，指数施肥方法已在杉木[10]、降香黄檀[11]、美国山核桃[12]、纳塔栎[13]、紫椴[14]等树种中得到研究和应用，这些研究大多关注于苗木生长和养分含量方面，但药用活性成分及养分累积量对指数施肥的响应特征尚不清楚。目前，红豆杉中药用活性成分10-DAB及养分累积对施肥的响应特征鲜有研究，指数施肥对云曼红豆杉苗期各指标的影响未见报道。因此，本研究以1 年生云曼红豆杉实生容器苗为试验对象，考察不同施肥处理对活性成分10-DAB含量及养分累积的影响，以期为云曼红豆杉苗期养分精准调控与苗木高效培育提供理论和实践依据。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验地位于四川省都江堰市红豆杉基地，地处都江堰市南部，距市区19 km左右。该地海拔700 m左右，属亚热带湿润季风气候，年均降水量1 243 mm，年均温17.1 ℃，年均日照时数1 045 h，无霜期269 d。

1.2 供试材料

试验所用苗木为“国家林业草原红豆杉西南工程技术研究中心”培育的1年生云曼红豆杉实生容器苗，育苗容器为无纺布袋(直径5.5 cm×高9.5 cm)，基质为当地的壤土。基质理化性质如下：pH 5.24，有机质 28.6 g·kg-1，全氮36.3 g·kg-1，有效磷20.18 mg·kg-1，速效钾 25.82 mg·kg-1。每个容器种植一株幼苗，为了防止水肥流失，装填基质前在容器内套双层透明塑料袋。2021年4月中旬，选取生长状况良好、无病虫害、长势一致的苗木开展试验。

1.3 试验设计

本试验采用完全随机区组设计，共设对照(CK，不施肥)，平均施肥处理AF1、AF2，以及指数施肥处理EF1、EF2、EF3、EF4，共计7个处理，每个处理设3次重复，每个重复70株云曼红豆杉容器苗。考虑云曼红豆杉生长周期及施肥操作的方便性，于2021年4月15日开始进行施肥，施肥间隔15 d，7月30日结束。选取通用型肥料普罗丹水溶性复合肥 (N 20%，P2O520%，K2O 20%)，为方便表达，将施N量作为养分施入量进行表达。

1) 平均施肥(CF)：在相同时间内施以等量的肥料。每次施肥量Nt=NT/t(Nt为施肥量，NT为N素总量，t为施肥次数)

2) 指数施肥(EF)：施肥总量根据上一年苗木初始养分NS和生长结束时的养分测定得出。

NT=NS(ert-1)

(1)

式中，NT为N素总量；NS为初始N含量；t为施肥次数；r为施肥速率。

本试验参照R.K Dumroese等[15]指数施肥模型来确定云曼红豆杉幼苗不同时期 N 素施用量。

Nt=NS(ert-1)-Nt-1

(2)

式中，NS、r 参照式(1)，Nt为在r下的第t次的施氮量，Nt-1为前t-1次施入的氮肥总量。7种处理各时期氮素施用量如表1所示。

表1 不同施肥方式及施肥量云曼红豆杉 1 年生实生容器苗不同时期 N 素施用量

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长量及枝叶生物量云曼红豆杉幼苗各生长指标及枝叶生物量自施肥开始至苗木生长结束，每隔4周测定一次。各施肥处理每个重复选取5株。苗高、地径分别采用钢尺和游标卡尺测量(0.01 cm)；枝叶生物量测定剪取红豆杉全部枝叶，105 ℃杀青30 min，然后在70 ℃下烘干至恒重，用电子天平(±0.01 g)测其干重。

1.4.2 枝叶中10-DAB含量及其累积量分别于5、7、9、11月中旬测定各施肥处理幼苗枝叶中10-DAB含量，各处理每个重复选5株，测定方法参照文献[16]。10-DAB累积量(产量)为枝叶10-DAB含量与枝叶生物量的乘积。

1.4.3 养分质量分数生长季结束后，各处理每个重复选取5株生长一致的完整云曼红豆杉幼苗，带回实验室冲洗干净，分别对根、茎、叶进行105 ℃杀青30 min，并烘干至恒重。全氮、全磷、全钾测定前样品采用H2SO4-H2O2消煮，全氮测量采用凯式定氮法[17]，全磷测量采用钼锑抗比色法[18]，全钾测量采用火焰分光光度计法[19]。

1.5 数据处理

使用SPSS 22.0软件进行数据统计及显著性差异分析(Duncan 法进行多重比较)，Origin 2018 进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理对云曼红豆杉生长及枝叶生物量的影响

图1显示，各施肥处理云曼红豆杉幼苗苗高、地径和枝叶生物量均显著高于对照(CK)，增幅分别为13.39%～32.67%、13.95%～63.59%和23.75%～77.82%。在相同施肥量条件下，指数施肥EF2处理苗高、地径和枝叶生物量较AF2分别显著增加了6.05%、28.62%和13.66%，EF1处理苗高比AF1显著降低，枝叶生物量则显著提高，而地径增加未达显著水平。EF2处理苗高地基和枝叶生物量均显著大于AF2(P<0.05)。在指数施肥处理中，云曼红豆杉幼苗苗高、地径和枝叶生物量随着施肥量的增加呈现先升后降的趋势，并均在EF2处理达到最高值，其苗高、枝叶生物量显著大于其他处理(P<0.05)，其地径仅显著高于EF4处理。总体而言，各施肥处理均能显著促进云曼红豆杉幼苗生长和生物量积累，适量指数施肥处理(EF2)的生长促进效应显著优于相应平均施肥处理，但指数施肥量过高反而会显著抑制这种促进效应。

不同小写字母表示不同处理间在0.05水平差异显著(P<0.05)，下同

同时，进一步分析发现，不同施肥处理云曼红豆杉幼苗各时期苗高、地径和枝叶生物量月增长百分比变化基本一致，均表现为缓慢增加→迅猛增加→缓慢增加→停滞的趋势(图2)。其中，5月15日至7月15日期间，各处理云曼红豆杉苗木生长和枝叶生物量累积缓慢增加，苗高增长量以AF1和EF4处理、地径增长量以EF1和EF2处理、枝叶生物量累积以AF1和EF3处理较大；从7月15日开始，云曼红豆杉苗木生长进入高峰期，苗高、地径以及枝叶生物量在7月15日 至 9月15日阶段增量均最大，各处理苗高、地径和枝叶生物量在此期间增长量占比分别为33%～59%、56%～68%和34%～55%；9月15日后各指标的增量逐渐下降，至11月几乎停止增长。

图2 不同施肥处理云曼红豆杉不同时期苗高、地径和枝叶生物量增长量百分比变化

2.2 不同施肥处理对云曼红豆杉枝叶中10-DAB含量和积累量的影响

图3显示，各施肥处理云曼红豆杉幼苗枝叶中10-DAB含量均显著高于同期不施肥对照(CK)。在相同施肥量条件下，各时期幼苗枝叶中10-DAB含量均表现为指数施肥处理EF1始终高于同期AF1处理，但无显著差异(P>0.05)，指数施肥处理EF2除9月份外均显著高于同期AF2，EF2处理幼苗枝叶中10-DAB含量比AF2增加最大达3.59%。指数施肥处理中，枝叶中10-DAB含量随施肥量增加表现为先增加后减少的趋势，均在EF3处理达到最高，并与FF2以外的其他处理差异显著，最低的EF4处理均较EF3处理显著下降，降幅最高达4.72%。同时，各处理枝叶中10-DAB含量随生长月份表现出相同的变化规律，即5-9月呈上升趋势，于9月时达到最高，在11月份又较9月份明显下降；9月各处理的10-DAB含量分别较5月依次增加了7.99%、8.91%、8.50%、8.20%、5.05%、9.12%和9.57%。

图3还显示，各施肥处理云曼红豆杉幼苗枝叶10-DAB累积量也均显著大于同期不施肥对照(CK)，各时期均以指数施肥处理EF2最高，并显著大于同期其他处理(P<0.05)。在相同施肥量条件下，指数施肥处理EF1的10-DAB累积量仅在9、11月份比相应AF1显著增加，而指数施肥处理EF2始终比相应AF2显著增加，增幅为18.14%～25.00%。在指数施肥处理中，枝叶10-DAB累积量随施肥量增加而先升后降，并在EF2处理达到最高，且与同期其余处理差异显著，在5、7、9、11月份分别是最低的EF4处理的1.22、1.20、1.42和1.40倍。另外，各处理枝叶10-DAB累积量随生长月份的变化均表现为先增加再下降相似变化趋势，即在5～9月逐渐上升，于9月达到最大值后下降，各处理最大月份10-DAB累积量(9月)分别较最小月份(5月)增加了59.41%、63.28%、81.15%、75.53%、71.21%、72.85%和61.88%。

图3 不同施肥处理云曼红豆杉枝叶中10-DAB含量和积累量

以上结果说明，各施肥处理均能显著促进云曼红豆杉幼苗枝叶10-DAB累积，并以指数施肥处理EF2效果最佳；适宜指数施肥处理的促进效应显著优于相应平均施肥处理，但指数施肥量过高反而会显著抑制这种促进效应；云曼红豆杉幼苗枝叶10-DAB含量和累积量均在9月份达到最高。

2.3 施肥处理对云曼红豆杉幼苗器官 N、P、K 含量及分配策略的影响

2.3.1 N、P和K 含量由图4可知，各施肥处理云曼红豆杉幼苗根、茎和叶中 N、P、K含量均不同程度地高于不施肥对照(CK)，但各处理N含量增幅较小，仅EF3处理的根、茎和叶和EF4处理根N含量达到显著水平，而P含量增幅在除AF1处1理外的根、茎以及EF2、EF3、EF4处理的叶中均达到显著水平，K含量增幅在除AF1处理外的根、茎、叶中均达到显著水平。在相同施肥量条件下，指数施肥处理EF1、EF2根、茎和叶中N、P、K含量均不同程度高于相应平均施肥处理，但仅部分器官的P、K含量存在显著差异。在指数施肥处理中，各处理根系中的N含量以及根、茎和叶的K含量均随着施肥用量的增加而上升，且EF4处理显著高于其他处理(P<0.05)；各部位P以及茎和叶中N含量均随施肥量增加表现出先上升后下降的变化趋势，且EF3处理显著大于EF1和EF2处理(P<0.05)。在平均施肥方式中，AF2处理中根、茎和叶中N、P和K含量大于AF1处理，但N含量差异未达到显著水平。以上结果表明云曼红豆杉幼苗各部位对N、P和K养分吸收能力存在差异，指数施肥下养分吸收效率更高。

图4 不同施肥处理下云曼红豆杉幼苗根茎叶的 N、P、K 含量的变化

2.3.2 养分分配策略从图5可知，各施肥处理云曼红豆杉幼苗N、P和K在各器官中分配比例均表现为叶>根>茎，N素在根、茎和叶中所占比重分别为13%～20%、4%～13%和72%～81%，P分别为18%～25%、5%～13%和68%～74%，K素分别为11%～19%、3%～9% 和 76%～82%。N、P和K各器官间的分配比例在施肥处理间存在明显差异，指数施肥相较平均施肥减少了N和P向根和茎的分配比例，增加了向叶的分配比例。指数施肥处理中，N、P、K素分配在根和叶中所占比例均随施肥量增加表现出先增加再减少的变化趋势，在茎中则表现为下降趋势；N、P和K在叶占比重最大为EF2处理，在茎中占比重最大为EF1处理，根中占比重最大为EF3处理。

图5 各施肥处理云曼红豆杉幼苗N、P、K 含量在各部位的分配

2.3.3 氮、磷、钾含量的相关性云曼红豆杉幼苗各部位N、P和K含量之间存在极强的相关关系(图6)。其中，幼苗根中N含量与其P、K 含量分别呈显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)正相关，其P含量与K含量呈极显著正相关；茎中N含量与P含量、P含量与K含量均呈显著在相关；叶中N含量与P、K含量，以及P含量与K含量均呈极显著正相关。说明各部位中N与P、P与K以及根、叶中的N与K表现出协同变化关系。

图6 云曼红豆杉幼苗根、茎和叶中氮、磷、钾含量间的相关性分析

3 讨 论

药用植物在施加矿质元素时需同时兼顾有效成分的含量与经济产量，科学合理的施肥可以有效提升药用植物有效成分的累积[20-21]。本研究结果发现，施肥对云曼红豆杉幼苗枝叶中10-DAB含量有促进作用，与对照相比最高增加了10%以上。矿质营养元素不仅是合成次生代谢产物的基础成分，还是作为关键酶的组分或活化剂参与各种代谢反应，影响次生代谢产物的药效成分组成和含量[22]；同时，施加适宜的矿质营养可提高药用植物品质，但养分过度或欠缺施用则不利于红豆杉幼苗药效成分的组成和积累，从而降低药材品质[23-24]。本研究结果也显示，施氮量小于2 400 mg·株-1或大于3 200 mg·株-1会抑制云曼红豆杉幼苗枝叶中药用成分10-DAB合成。在指数施肥方式下，云曼红豆杉幼苗枝叶中10-DAB含量随施肥量增加表现为先上升再降低的趋势，可能是由于随施肥量增加，云曼红豆杉幼苗对矿质元素的吸收受抑制，导致次生代谢产物的合成途径相关酶基因活性降低，抑制了有效成分10-DAB的合成，该结果与卢丽兰等[25]关于高氮不利于广蕾香有效成分积累的研究结果一致。

另外，枝叶生物量可有效反映出苗木积累干物质的能力，也是衡量有效成分累积量的重要标准之一[26]。本研究结果表明，在施肥量适中的情况下，云曼红豆杉幼苗枝叶生物量表现为指数施肥 >平均施肥 >CK，这与前人对池杉(Taxodiumascendens)[27]、赤皮青冈(Cyclobalanopsisgilva)[28]、白桦(Betulaplatyphylla)[29]等的研究结果相一致，表明指数施肥较平均施肥更能促进云曼红豆杉幼苗枝叶生物量累积。其原因可能是由于指数施肥与其他施肥方式相比，能够较大程度地满足云曼红豆杉在不同生长时期对养分的需求，且指数施肥生长速率稳定，更有利于红豆杉幼苗生长[30-31]；同时云曼红豆杉幼苗的苗高、地径对施肥的响应与枝叶生物量含量一致，这也表明了在苗木生长发育过程中，各生长指标之间存在一定协同性，会相互影响[32]。

实际生产过程中，药用植物往往很难兼顾有效成分含量与产量，生长分化平衡假说认为，在生长资源匮乏时，植物的生长和分化均减小[33]。在本研究中，云曼红豆杉枝叶中10-DAB含量最高为EF3处理，枝叶生物量最高为EF2处理，表明枝叶生物量最高的施肥处理，其次生代谢产物含量并不最多，这与生长分化平衡假说一致。综合本研究中云曼红豆杉10-DAB含量与枝叶生物量来看，当施肥方式为指数施肥，施肥量为1 600 mg·株-1，生长月份为9～10月份时，此时采收可获得的10-DAB累积量最高，收益最大。

此外，苗木体内的营养元素水平能反映出苗木是否健壮、施肥是否合理[34]。施肥可显著提高苗木根、茎、叶中的元素累积[35-36]，本研究结果也证实了这一点，施肥处理EF3云曼红豆杉幼苗的N、P和K含量最高分别高出对照(CK) 31.27%、288.29%、130.65%。同时，在相同施肥量条件下，指数施肥处理的云曼红豆杉幼苗各部位的N、P和K含量均大于相应的平均施肥处理，这一结果与前人关于指数施肥可提高苗木养分积累的结果相一致[37]，其原因是苗木生长后期存在“奢养消耗”现象，指数施肥处理增加了苗木体内更多的养分承载[38]。养分供应量不足时，苗木养分含量与养分供给量成正比，但当养分供给超过苗木的最佳需求时，养分含量不会继续增加，甚至会下降[39-40]。本研究中，当施肥量超过1 600 mg·株-1时，云曼红豆杉幼苗各部位的P含量以及茎和叶中N含量均出现了下降，而根中的N含量以及各部位的K含量则随施肥用量的增加而上升，表明云曼红豆杉幼苗各部位养分吸收能力存在差异，1 600 mg·株-1的施肥用量可能超过了云曼红豆杉幼苗各部位对P元素以及茎和叶对N元素需求的阈值，这与Malik等[41]和李双喜等[42]的研究结果一致。本研究中各施肥处理云曼红豆杉幼苗中 N、P和K元素含量的分配情况相一致，各部位矿质元素含量表现为叶>根>茎，该研究结果与吴家森等[43]对南方红豆杉1年生和2年生幼苗的相关研究结果相一致，表明叶是养分重要的储藏器官[44]。本研究中云曼红豆杉叶片吸收营养元素含量总体呈现出N>K>P的趋势，表明其对N和K具有高富集特性。此外，有研究表明施加氮素会影响植物对磷钾的吸收[45]，本研究中云曼红豆杉幼苗根、茎、叶中N与P、P与K以及根、叶中的N与K呈显著正相关(P<0.05)，表明根和叶中的N、P和K吸收具有协同作用；而茎中N和K的含量为正相关(相关系数0.614)，但相关性不显著(P>0.05)。

综上所述，施肥显著促进了云曼红豆杉幼苗生长、枝叶生物量累积，提高了药用有效成分10-DAB含量及累积量，促进了器官中营养元素N、P和K的累积；在本试验条件下，采用指数施肥方式，施肥量1 600 mg·株-1最有利于云曼红豆杉幼苗药用活性成分10-DAB及养分累积。