维生素B6对非小细胞肺癌的放疗增效作用

司少艳，申玉龙，秦亚亚，吴莹莹，王宗烨，宋淑军#

战略支援部队特色医学中心1综合基础研究室，2放疗科，北京 100101

肺癌目前是世界上也是中国肿瘤死亡人数最多的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的80%以上[1]。目前肺癌的治疗以综合治疗为主，其中放疗是重要的治疗手段之一。然而，射线杀死肿瘤细胞的同时也会产生不良反应，导致并发症，此外，肿瘤细胞的放射抵抗或不敏感是影响放疗效果的重要因素。因此，为了提高疗效，减少并发症及射线的抗性，开发具有放疗增效作用的药物，提高辐射对NSCLC细胞的毒性，减少不良反应，增加放射敏感性，对改善肿瘤患者的临床预后具有非常重要的意义。理想情况下，无毒而且能够增强辐射对肿瘤细胞杀伤作用的化合物为首选，因此，无毒副作用的天然产物逐渐得到人们的关注。维生素是维持人体正常功能所必需的营养素，在新陈代谢过程中发挥着重要作用。维生素B6（vitamin B6，VB6）是一种水溶性维生素，由含有2-甲基-3-羟基吡啶结构的6种化合物组成，分别为吡哆醇（PN）、吡哆胺（PM）、吡哆醛（PL）及磷酸化衍生物5'-磷酸吡哆醇（PNP）、5'-磷酸吡哆胺（PMP）和5'-磷酸吡哆醛（PLP），这6种化合物可相互转换。PLP是VB6的活性形式，作为一种辅酶，在体内参与160多种不同的生化反应，对维持人体正常生理机能具有重要意义，VB6的缺乏或代谢异常与包括肿瘤在内的多种临床疾病有关[2]。越来越多的研究显示，VB6缺乏与肿瘤之间存在一定的关联，VB6摄入量和血液PLP水平与结直肠癌发生风险均呈负相关[3]。有学者报道，VB6摄入和高血浆PLP水平可以作为胰腺癌的保护因子[4]。VB6缺乏还与肺部肿瘤发生风险有关[5]，膳食VB6可以通过抑制肿瘤细胞的增殖，减少氧化应激、一氧化氮生成和血管生成，促进肿瘤细胞的凋亡以及增强免疫反应来抑制肿瘤的发生[6-7]。尽管关于VB6的抗肿瘤效应的报道较多，但VB6是否具有放疗增效以及增敏作用尚不清楚。本研究通过观察VB6与X线联合使用对肺癌A549细胞存活作用的影响，了解VB6与X线对NSCLC细胞的协同杀伤效应及放疗增效作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

NSCLC细胞A549由美国模式菌种收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）细胞库提供。RPMI1640细胞培养基购自美国GE医疗生命科学公司，胎牛血清购自上海依科赛生物制品有限公司，瑞氏-姬姆萨染液购自北京雷根生物技术有限公司。VB6购自河南润弘制药股份有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养 采用改良的RPMI1640培养液，含有10%胎牛血清以及青霉素和链霉素各100 U/ml，在37℃、5% CO2空气中进行细胞培养，每2～3天换液一次，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 细胞照射 采用AXESSE直线加速器，6 MV X线照射，照射源轴距为100 cm。单次照射剂量分别为0、2、4、6 Gy，剂量率为4 Gy/min。

1.2.3 细胞克隆形成实验 将A549细胞稀释成单细胞悬液，然后接种于6孔板中，每孔200个细胞，待4～6 h细胞贴壁后，用含有不同浓度的VB6培养基处理细胞，分别设置为低浓度组（125 μg/ml）、中浓度组（250 μg/ml）、高浓度（500 μg/ml）以及对照组（0 μg/ml），药物处理8天后，用4%的多聚甲醛进行固定，瑞氏-姬姆萨染液进行染色。部分细胞待VB（60、250 μg/ml）处理细胞1天后，进行X线照射，然后在培养箱中继续培养，用含原相同浓度的VB6培养基每2～3天换液一次，药物处理8天，于照射后第8天（照射后满7天），将细胞固定并染色，然后在显微镜下观察，对细胞克隆（≥50个细胞的细胞团）进行计数，计算克隆形成效率和存活分数，克隆形成效率=每孔的克隆数/每孔接种细胞数×100%，存活分数=处理组的克隆数（/该组每孔接种细胞数×对照组的克隆形成效率）×100%。

1.2.4 药物增敏作用 药物的辐射增敏作用可以通过辐射增强比值（radiation enhancement ratio，RER）来判定。RER（xGy）=单独X线处理细胞的存活分数/VB6联合X线处理细胞的存活分数，RER大于1表示药物有放射增敏作用[8]，该比值越大说明VB6对射线的增效作用越强。

1.2.5 药物相互作用评价 两种药物或治疗方法合并使用时，可产生不同的效果，相互作用结果可以通过相互作用系数（coefficient of drug interaction，CDI）进行判断，根据Cohen等[9]介绍的方法，CDI=AB（/A×B）。A为单独VB6处理细胞后的存活率，B为X线单独作用于细胞后的存活率，AB为VB6与X线联合作用于细胞后的存活率。CDI=1为两者作用相加，即联合治疗所得疗效为两种药物或疗法的疗效之和；CDI＞1为拮抗作用，即联合治疗所得疗效比两种药物或疗法的疗效之和小；CDI＜1为协同作用，即联合治疗所得疗效比两种药物或疗法的疗效之和大，CDI＜0.7为显著的协同作用。为了减少偏差，CDI相加作用的判断可扩展至0.9～1.1。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件分析数据，计数资料以-例数及率（%）表示；计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验；VB6与X线的交互作用采用析因分析法；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VB6对A549细胞克隆形成能力的影响

VB6呈剂量依赖性地抑制A549细胞克隆形成，随着VB6浓度升高，细胞克隆数逐渐减少，克隆形成效率及存活分数均逐渐降低（P＜0.05）。中浓度组、高浓度组A549细胞克隆数、克隆形成效率及存活分数均低于对照组，中浓度组、高浓度组A549细胞克隆数、克隆形成效率及存活分数均低于低浓度组，高浓度组A549细胞克隆数、克隆形成效率及存活分数均低于中浓度组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 VB6对A549细胞克隆形成能力的影响（±s）

表1 VB6对A549细胞克隆形成能力的影响（±s）

注：a与对照组比较，P＜0.05；b与低浓度组比较，P＜0.05；c与中浓度组比较，P＜0.05

组别对照组低浓度组中浓度组高浓度组F值P值1 3 0.3±9.6 1 2 4.0±5.0 1 0 6.7±6.5 a b 8 0.3±7.5 a b c 2 7.7 8 2＜0.0 5 6 5.2±4.8 6 2.0±2.5 5 3.3±3.3 a b 4 0.2±3.8 a b c 2 7.7 8 2＜0.0 5 1 0 0.0±7.4 9 5.1±3.8 8 1.8±5.0 a b 6 1.3±5.7 a b c 2 7.7 8 2＜0.0 5克隆数克隆形成效率（%）存活分数（%）

2.2 VB6对放疗的增效作用

X线照射后A549细胞克隆形成数量减少，克隆形成效率降低，X线呈剂量依赖性地抑制细胞克隆形成，2、4、6 Gy照射组细胞存活分数分别较未照射组细胞下降了49.1%、78.0%和97.2%（F=487.410，P＜0.01）。VB6与X线联合处理细胞，可使X线照射对细胞存活的抑制作用更为明显，VB6（250 μg/ml）与2、4、6 Gy的射线联合处理细胞的存活分数进一步下降，与未照射组比较，分别下降了63.2%、87.0%和99.0%（F=3.997，P＜0.01）。虽然250 μg/ml的VB6单独处理细胞使A549细胞的存活分数只下降18.2%，但其与2 Gy的射线联合处理细胞则可使细胞的存活分数较单独照射组进一步下降14.1%。X线×VB6析因分析发现，VB6和X线均能降低细胞的存活分数，且两者有明显的交互作用。（表 2）

表2 X线单独-及与VB6联合治疗对A549细胞存活分数的影响（%，±s）

表2 X线单独-及与VB6联合治疗对A549细胞存活分数的影响（%，±s）

注：a与0 Gy比较，P＜0.05；b与2 Gy比较，P＜0.05；c与4 Gy比较，P＜0.05

方法X线X线+V B 6 1 0 0.0±7.4 8 1.8±5.0 5 0.9±5.0 a 3 6.8±4.7 a 2 2.0±4.2 a b 1 3.0±2.3 a b 2.8±0.4 a b c 1.0±0.4 a b c 0 G y 2 G y 4 G y 6 G y

2.3 药物相互作用

VB6与2、4、6 Gy X线相互作用的CDI分别为0.88、0.72和 0.44，均小于 1，说明 VB6和 X 线对A549细胞具有协同抑制作用，而非简单的相加作用，而且射线剂量为4 Gy和6 Gy时协同作用比2 Gy时更显著。此外，VB6（250 μg/ml）对2、4、6 Gy剂量射线的RER分别为1.38、1.69和2.75，均大于1，说明VB6对X线抑制细胞存活效应有明显增效作用，具有辐射增敏作用。

3 讨论

VB6作为人体必需的一种维生素，在体内参与多种物质的代谢，对维持人体正常的生理机能具有重要意义。VB6的缺乏或代谢异常与包括肿瘤在内的多种疾病的发生有关[2]。尽管研究结果不一致，但越来越多的研究显示VB6可能与多种肿瘤的发生有关，如胃肠道癌[3]、胰腺癌[4]、乳腺癌[10]和前列腺癌[11]等。对于全球肿瘤死亡人数最多的肺癌，与VB6同样存在着一定的关联，一项包括8000多例肺癌患者的荟萃分析研究显示，VB6缺乏与肺部肿瘤的增加有关[12]。另外一项大规模人群研究结果表明，血清VB6水平与NSCLC的发生风险呈负相关[13]。然而，调查研究结果并不完全一致，一项研究发现VB6只与欧洲和亚洲吸烟的男性肺癌患者具有微弱关联[14]。而前瞻性队列研究并未发现血清VB6与肺癌发生风险之间存在关联[15]，因此，有关VB6与肺癌之间的关系仍有待于进一步的研究。本研究结果显示，VB6在体外呈剂量依赖性地抑制A549细胞克隆形成，500 μg/ml的 VB6可以使细胞存活分数下降近40%，说明VB6使该细胞的存活能力受到明显抑制，该研究结果支持VB6对NSCLC具有抑制作用。NSCLC患者的红细胞VB6水平降低[16]，吡哆醛激酶（一种将VB6前体转化为PLP的酶）的水平升高已被证明是NSCLC患者良好的、独立于治疗的预后标志物[17]，这些研究结果表明VB6可能是NSCLC的保护因子。

VB6除了本身具有一定的抗肿瘤活性外，与化疗药物联合使用具有增强药物对肿瘤细胞毒性的作用，体外实验显示PN在多种肿瘤细胞系（NSCLC、卵巢癌、宫颈癌、骨肉瘤、间皮瘤、结直肠癌以及多个不同的顺铂耐药细胞系）中可增强顺铂对细胞的毒性作用[17]。在NSCLC小鼠模型中，进行肿瘤内注射PN同样可以增强化疗药物顺铂的抗肿瘤作用，VB6可以增强顺铂对A549细胞的细胞毒性作用，加剧顺铂导致的DNA损伤[17]。有报道使用一种昆虫源性中药斑蝥酸钠和VB6的组合，与铂类化疗药物联合使用，能提高NSCLC的治疗效果，减少肿瘤复发和化疗不良反应，改善患者的生活质量和免疫功能[18]。然而，目前有关VB6对放疗增效作用的报道很少，有学者发现PN可以使A549细胞对高剂量（50 Gy）γ-射线的敏感性增强[17]，然而，射线的种类及放射剂量不同，药物的影响会有很大差异[19]。本研究结果显示，在X线照射剂量为2、4、6 Gy时，VB6可以增强X线对A549细胞的抑制作用，不同剂量射线与VB6联合使用均较两者单独使用的抑制作用增强，CDI均小于0.9，说明VB6与X线联合使用对A549细胞具有协同抑制作用，而非单纯的叠加效应，特别是在4 Gy和6 Gy时CDI更低，说明协同抑制作用更显著，联合治疗显示出比单一治疗更大的细胞效应。因此，NSCLC放疗过程中适当补充VB6有可能对增强NSCLC的放疗效果具有一定的帮助。

此外，本研究结果还显示VB6（250 μg/ml）对2、4、6 Gy剂量射线的RER均大于1，说明VB6具有一定的放疗增效作用。放射抵抗是影响肿瘤放疗效果的直接因素，提高肿瘤的放疗敏感性是医学研究的热点课题，放疗增敏剂能够增强射线对肿瘤细胞的杀伤作用，提高肿瘤细胞对放疗的敏感性，提高肿瘤的放疗效果，因此，VB6的放疗增效作用值得进一步探讨。

VB6不仅可以直接抑制NSCLC细胞的存活，而且与X线联合应用起到协同抑制以及辐射增敏作用，VB6的这些特性有可能使其成为NSCLC放疗过程中联合治疗的候选化合物。