紫檀芪通过上调自噬对2型糖尿病心肌损伤的保护作用

李泽霖，纪兆乐，周海佳，刘鹏云，赵 佩

(空军军医大学第二附属医院心内科，西安 710038；*通讯作者,E-mail:zhao-peigy@163.com)

在糖尿病患者中，观察到多种心脏结构重构，如心室扩张、显著间质纤维化、心脏舒张及收缩功能不全和左心室肥厚[1]。这种疾病过程被称为糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)，它是一种心肌特异性疾病，也是导致糖尿病患者高病死率的重要并发症之一，目前迫切需要对糖尿病心肌病的发病机制有一个全面的认识[2]。近年来，许多研究已经明确了自噬在糖尿病心肌病发生发展中的作用[3]。据报道，凋亡和自噬水平的稳定都是细胞存活所必需的，在Ⅰ型糖尿病动物模型中，其心脏自噬受到抑制，同时心肌细胞凋亡明显增加，继而出现显著的心功能不全[4,5]。然而在2型糖尿病心肌病心肌损伤中自噬发挥的作用仍有待探究。

紫檀芪(pterostilbene,PTE)是一种天然的白藜芦醇类似物，具有多种药理活性，包括抗癌、抗炎、抗氧化和抗糖尿病等[6]。大量研究表明紫檀芪在心血管相关疾病中发挥了显著的保护效应[7-9]。并且有研究报道紫檀芪可以刺激细胞保护性自噬，从而帮助清除人脐静脉血管内皮细胞中积累的毒性氧化低密度脂蛋白，进而抑制细胞凋亡[10]。然而，紫檀芪能否同样减轻糖尿病心肌病心肌损伤及自噬在其中的作用尚不清楚。因此，本研究采用2型糖尿病心肌病模型，以探讨紫檀芪对模型小鼠心肌损伤的保护作用，并进一步明确其对心肌自噬及自噬通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

SPF级雄性C57BL/6小鼠60只，体质量20～25 g，购自空军军医大学实验动物中心，许可证号：SYXK(陕)2019-001。紫檀芪和链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)购自美国Sigma-Aldrich公司；末端脱氧核苷酸末端标记(TUNEL)检测试剂盒购自瑞士Roche公司；乳酸盐脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和肌酸激脢(creatine kinase-MB,CK-MB)ELISA试剂盒购自美国R&D公司；肌球蛋白样BCL2结合蛋白1(Beclin1)、单磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、p-AMPK、胶原蛋白1(Collagen Ⅰ)、自噬受体蛋白(p62)、微管相关蛋白轻链3(LC3)、哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin,mTOR)、p-mTOR、裂解半胱天冬酶3(cleaved Caspase-3)抗体购自美国Cell Signalling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立及分组处理 2型糖尿病心肌病小鼠模型建立方法如下：小鼠正常饲料适应性喂养1周后，给予高脂饲料喂养1个月。空腹12 h后，腹腔注射50 mg/kg新配置的STZ(避光溶于0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液)，连续注射3 d。自STZ第一次注射1周后，经尾静脉采血测定随机血糖，血糖浓度≥16.7 mmol/L被视为造模成功并纳入后续研究。对照组小鼠腹腔注射等量的柠檬酸钠缓冲液处理。模型组小鼠后续实验继续给予高脂饲料喂养4个月，而对照组小鼠则继续给予正常饲料喂养4个月。

将60只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组(Con)、药物对照组(Con+PTE)、模型组(DCM)和紫檀芪组(DCM+PTE)，每组15只。紫檀芪组小鼠在2型糖尿病心肌病造模成功后给予紫檀芪[10 mg/(kg·d)]灌胃给药处理，药物对照组小鼠则在紫檀芪组小鼠同时间点灌胃给药处理，正常对照组和模型组小鼠仅给予正常饮用水处理。所有处理在造模成功后4个月停止实验并行心脏超声及后续指标检测。

1.2.2 心脏功能检测 小鼠用异氟醚混合纯氧吸入麻醉，持续维持至超声心动图检测结束。胸骨旁短轴视图采用13～24 MHz线性阵列换能器系统，以获取乳头肌水平的短轴视图。记录3个具有代表性的心脏周期，并对每次测量取平均值。使用测量值计算左心室射血分数(LVEF)和左心室短轴缩短率(LVFS)以代表心脏收缩功能。利用多普勒频谱技术测定二尖瓣舒张早期血流速度峰值(E)、二尖瓣舒张晚期血流速度峰值(A)，并计算出E/A比值以代表心脏舒张功能。

1.2.3 血清生化检测 小鼠颈动脉取血，静置离心后获取上层血清，严格按照ELISA试剂盒说明书检测血清中的LDH和CK-MB的水平。

1.2.4 心肌组织病理及免疫组化染色 取小鼠心脏标本，经4%的多聚甲醛固定48 h后进行石蜡包埋。使用显微切片机切割成5 μm厚的切片。切片常规Masson染色以显示组织中胶原纤维。心脏切片用3%过氧化氢阻断，洗涤后用抗Collagen Ⅰ抗体(1 ∶500)和LC3B抗体(1 ∶500)孵育过夜。冲洗后，切片与二抗孵育，显微镜观察并拍照，用Image J软件分析Collagen Ⅰ胶原沉着及LC3B荧光表达程度。

1.2.5 心肌组织TUNEL染色检测细胞凋亡 采用TUNEL方法检测心肌凋亡细胞。将心脏组织切片脱蜡，然后用蛋白酶K(30 mg/ml)在37 ℃下孵育30 min。用磷酸盐缓冲盐水洗涤3次后，与TUNEL反应混合物在37 ℃黑暗环境下孵育1 h。为鉴定心肌细胞核，将DAPI染液滴在切片上，室温孵育5 min，荧光显微镜观察。在给定的观察范围内，通过TUNEL染色的心肌细胞数量与DAPI染色的心肌细胞总数的比值计算出凋亡的心肌细胞百分比或凋亡指数。

1.2.6 Western blot检测蛋白表达 将心脏组织匀浆，置于裂解缓冲液中冰上裂解30 min，收集上清液，采用Bradford蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。相同样品(总蛋白40 μg)上样，用SDS-PAGE分离。蛋白质通过电泳转移系统转移到硝化纤维素膜上。用5%的脱脂奶粉在室温下封闭膜1 h，然后与一抗(包括Beclin1、AMPK、p-AMPK、p62、LC3、mTOR、p-mTOR、cleaved Caspase-3和β-actin)(稀释比例均为1 ∶1 000)在4 ℃下孵育一夜。用TBST洗涤3次(每次15 min)后，将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育2 h。用增强的化学发光系统检测蛋白条带，用Image J软件对条带进行扫描和密度分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 紫檀芪明显改善2型糖尿病小鼠心脏功能障碍

与正常对照组相比，模型组小鼠的心脏收缩功能指标LVEF、LVFS和心脏舒张功能指标E/A值均显著降低(P<0.01)，表明小鼠心脏功能严重障碍；紫檀芪干预治疗后，与模型组相比，紫檀芪组小鼠的LVEF、LVFS和E/A值均显著升高(P<0.01)，表明小鼠心脏功能得到明显改善；而与正常对照组相比，药物对照组小鼠上述指标变化差异无统计学意义(P>0.05，见图1)。

与正常对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01图1 心脏超声检测的各组小鼠心脏功能相关指标的比较Figure 1 Comparison of myocardial function detected by echocardiography between groups

2.2 紫檀芪明显减轻2型糖尿病小鼠心肌损伤

与正常对照组相比，模型组小鼠血清中LDH和CK-MB浓度显著升高(P<0.01)，表明小鼠心肌细胞明显损伤；紫檀芪干预治疗后，与模型组相比，紫檀芪组小鼠血清中LDH和CK-MB浓度显著降低(P<0.01)，表明小鼠心肌细胞损伤得到明显减轻；而与正常对照组相比，药物对照组小鼠上述指标变化差异无统计学意义(P>0.05，见图2)。

与正常对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01图2 各组小鼠心肌损伤标志物表达比较Figure 2 Comparison of expression of myocardial injury markers between groups

2.3 紫檀芪明显抑制2型糖尿病小鼠心肌组织纤维化

与正常对照组相比，模型组小鼠心肌组织Masson染色蓝紫色着色及Collagen Ⅰ胶原沉着显著加重(P<0.01)，表明小鼠心肌组织发生明显纤维化；紫檀芪干预治疗后，与模型组相比，紫檀芪组小鼠心肌组织Masson染色蓝紫色着色及Collagen Ⅰ胶原沉着显著减轻(P<0.01)，表明小鼠心肌组织纤维化程度明显减轻；而与正常对照组相比，药物对照组小鼠上述指标变化差异无统计学意义(P>0.05，见图3)。

蓝紫色染色代表胶原纤维染色；棕褐色染色代表Collagen Ⅰ染色;与正常对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01图3 各组小鼠心肌组织纤维化程度比较Figure 3 Comparison of the degree of myocardial fibrosis between groups

2.4 紫檀芪明显抑制2型糖尿病小鼠心肌细胞凋亡

与正常对照组相比，模型组小鼠绿色荧光显示的凋亡心肌细胞显著增加，凋亡蛋白cleaved Caspase-3表达显著升高(P<0.01)，表明小鼠心肌组织发生明显的细胞凋亡；紫檀芪干预治疗后，与模型组相比，紫檀芪组小鼠绿色荧光显示的凋亡心肌细胞显著减少，凋亡蛋白cleaved Caspase-3表达显著降低(P<0.01)，表明小鼠心肌组织细胞凋亡得到明显抑制；而与正常对照组相比，药物对照组小鼠上述指标变化差异无统计学意义(P>0.05，见图4，5)。

绿色荧光代表凋亡细胞核染色，蓝色荧光代表所有细胞核染色与正常对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01图4 各组小鼠心肌细胞凋亡率比较Figure 4 Comparison of the apoptosis rate of myocardial cells between groups

与正常对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01图5 各组小鼠心肌细胞凋亡蛋白表达比较Figure 5 Comparison of apoptotic protein expression in myocardial cells between groups

2.5 紫檀芪明显增强2型糖尿病小鼠心肌组织自噬水平

与正常对照组相比，模型组小鼠心肌组织Beclin1及LC3B蛋白红色荧光表达显著降低，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例显著下降，p62蛋白表达明显增加(均P<0.01)，表明小鼠心肌组织自噬明显减低；紫檀芪干预治疗后，与模型组相比，紫檀芪组小鼠心肌组织Beclin1及LC3B蛋白红色荧光表达显著增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例显著上升，p62蛋白表达明显减低(均P<0.01)，表明小鼠心肌组织自噬得到明显增强；而与正常对照组相比，药物对照组小鼠上述指标变化差异无统计学意义(P>0.05，见图6，7)。

与正常对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01图6 各组小鼠心肌组织自噬蛋白表达比较Figure 6 Comparison of autophagy protein expression in myocardial tissue between groups

红色荧光代表LC3B荧光染色，蓝色荧光代表细胞核染色与正常对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01图7 各组小鼠心肌组织自噬蛋白LC3B荧光表达比较Figure 7 Comparison of fluorescence expression of autophagy protein LC3B in myocardial tissue between groups

2.6 紫檀芪明显促进2型糖尿病小鼠心肌组织AMPK/mTOR通路表达

与正常对照组相比，模型组小鼠心肌组织p-AMPK/AMPK比值明显降低，p-mTOR/mTOR比例显著升高(P<0.01)，表明小鼠心肌组织AMPK/mTOR通路表达明显抑制；紫檀芪干预治疗后，与模型组相比，紫檀芪组小鼠心肌组织p-AMPK/AMPK比值明显上升，p-mTOR/mTOR比例显著减低(P<0.01)，表明小鼠心肌组织AMPK/mTOR通路表达得到明显促进；而与正常对照组相比，药物对照组小鼠上述指标差异无统计学意义(P>0.05，图8)。

与正常对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01图8 各组小鼠心肌组织AMPK/mTOR通路表达比较Figure 8 Comparison of the expression of AMPK/mTOR between groups

3 讨论

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢紊乱，可引起不同器官的长期损害和功能障碍。糖尿病心肌病是糖尿病的常见并发症，也是糖尿病患者的最大死亡风险之一[11]。然而，在无症状糖尿病阶段，尽管有病理进展，糖尿病心肌病在很大程度上仍未被识别。糖尿病心脏中高血糖介导的心肌细胞死亡的增加，可以解释糖尿病中心脏相关发病率和死亡率的增加[12]。尽管对糖尿病心肌病病理生理学的认识有了重大进展，但治疗选择仍然非常有限[13]。

紫檀芪作为一种白藜芦醇的衍生物，不仅具有多种生物活性，且生物利用度比白藜芦醇更高、更稳定[6]。近年来其在心肌梗死[7]、心肌缺血再灌注损伤[14]、心力衰竭[9]、脓毒症心肌损伤[15]等许多心血管相关疾病中发挥的治疗效应得到了广泛的验证。在本研究中，我们首先证明了2型糖尿病小鼠表现出明显的心功能障碍及心肌损伤。继而给予紫檀芪治疗后观察到，糖尿病小鼠心脏收缩和舒张功能得到明显改善，且血清中LDH及CK-MB水平显著降低，表明紫檀芪同样可作为一种新的治疗选择用以减轻长期高血糖诱导的心脏损伤。

心肌细胞肥大、凋亡和纤维化被认为是糖尿病心肌病最终发展为心力衰竭的3个主要特征[16]。在人类和动物糖尿病模型中，高血糖引起的上述心肌病理改变也是导致糖尿病心肌病及其继发心功能障碍的主要机制[17,18]。本研究同样观察到，2型糖尿病小鼠心肌组织纤维化程度显著，凋亡的心肌细胞明显增加。而给予紫檀芪治疗后其心肌组织纤维化及Collagen Ⅰ胶原沉着得到明显缓解，且心肌细胞凋亡也被显著抑制，以上结果进一步验证了紫檀芪在减轻糖尿病心肌损伤中的保护作用。

随着对糖尿病研究的进展，自噬被认为是糖尿病心肌病发生发展的新机制之一[3,19]。自噬是一种进化保守的分解代谢过程，用于降解和循环长寿蛋白和受损的细胞器。生理条件下低水平的自噬发挥细胞保护和质量控制过程[20]。糖尿病心肌病在1型和2型糖尿病患者中均有发生，1型和2型糖尿病心肌病的发病机制和临床特征可能部分不同[21]。Xu等[22]报道自噬减少是一种适应性反应，可限制1型糖尿病患者的心功能不全。而对胰岛素抵抗的2型糖尿病模型，自噬调控对2型糖尿病心脏的作用有待进一步明确。此外，zhang等[10]报道紫檀芪可以刺激细胞保护性自噬，从而帮助清除人脐静脉血管内皮细胞中积累的毒性氧化低密度脂蛋白，进而抑制细胞凋亡，然而其在2型糖尿病中对心肌细胞自噬的作用也仍待确定。本研究发现，与正常对照组相比，模型组小鼠心肌自噬蛋白Beclin1的表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例显著下调，LC3B荧光表达明显减低。而给予紫檀芪治疗后其心肌组织自噬流明显增强，表明提高自噬水平对改善2型糖尿病心肌损伤具有显著作用。

到目前为止，有几种细胞信号通路被推测在高糖下开启自噬[3]。单磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMPK)是心脏能量代谢的关键调控因子，参与细胞生长、凋亡和自噬等过程的调节，对维持心血管正常功能发挥重要的生物学作用[23]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)也是一种细胞生长和增殖的重要调节因子，在维持基础自噬水平上同样发挥关键作用[24]。此外，AMPK的激活会抑制自噬负调控因子mTOR，进而刺激自噬的发生[25]。近年来，人们越来越多地关注AMPK/mTOR通路在糖尿病心肌病发病机制中的潜在作用，以及AMPK刺激剂用于治疗此种疾病可能性[26]。然而该通路在介导紫檀芪调节自噬进而发挥抗糖尿病心肌损伤中的作用尚不明确。本研究发现，2型糖尿病心肌组织AMPK/mTOR通路明显被抑制，心肌自噬显著减低。而给予紫檀芪治疗后其心肌组织AMPK/mTOR通路明显被激活，心肌自噬显著增强。我们的发现支持了这样一种观点，即通过外源性补充紫檀芪药理激活AMPK/mTOR通路来增强心肌细胞的自噬可能是治疗2型糖尿病的一种新策略。

综上所述，本研究通过评价高脂饮食联合STZ诱导的2型糖尿病小鼠的心功能、组织病理变化和分子生物学改变，证实了2型糖尿病心肌病的发生，并论证了自噬可能在紫檀芪减轻2型糖尿病心肌病心肌损伤中起着重要作用。紫檀芪激活的AMPK/mTOR通路可能是其诱导自噬继而发挥保护作用的关键调节机制。本研究为紫檀芪的治疗性应用或自噬激活可能为2型糖尿病心肌病的治疗方式提供了新的思路。