HPLC波长切换法同时测定血脂灵片中7种成分的含量*

王艳萍，李 宏，李 鹏

（商洛市药品检验所，陕西 商洛 726000）

血脂灵片是在中医基础理论指导下，由泽泻、决明子、山楂、制何首乌4味中药饮片按照中药剂型工艺制备而成的中药复方制剂。该制剂具有化浊降脂、润肠通便的功效，用于临床上的痰浊阻滞型高脂血症，如头晕胸闷、大便干燥等症。2015年版《中华人民共和国药典》（一部）中收载了该处方中决明子和制何首乌的定量方法；郑艳超等[1]和张华等[2]曾对该制剂中决明子药材中的蒽醌类成分进行了定量分析。中药发挥疗效的固有特性是多组分、多靶点协同作用，而仅控制单一中药有效成分群的含量，难以客观、全面地评价产品的质量。

处方中的君药泽泻始载于《神农本草经》，被列为上品，其味甘性寒，主入肾、膀胱经，具有利水、渗湿、泻热、化浊降脂的功效，主治高血脂、小便不利、水肿胀满、泻痢、痰饮、呕吐等病症[3]。泽泻的主要化学成分有三萜、倍半萜、糖类、黄酮、甾体、苯丙素等，其中三萜类成分（23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C等）具有降血脂、保肝、降血糖、抗结石、保护肾脏、抗癌、利尿、抗炎、抗氧化等药理作用[4-12]。臣药决明子性微寒，味苦甘咸，主入肝、肾、大肠经，有润肠通便、降脂明目的功效，在治疗高血压、头痛、眩晕、急性结膜炎、角膜溃疡、青光眼、痈疖疮疡等病症中有一定的疗效。决明子主要化学成分为蒽醌类、吡酮类和脂肪酸类等成分，其中蒽醌类成分（橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等）具有降压、清肝明目、泻下、抑菌等药理作用[13-18]。目前对血脂灵片中君药（泽泻）和臣药（决明子）中所含的多种有效成分群含量进行同时测定的报道鲜见，故本研究旨在同时测定血脂灵片中7种化学成分的含量。

由于中药复方中有效成分较为复杂，药效物质基础不明确，而品种、产地、加工方法等因素对单味中药材的质量影响较大，使得中药复方制剂的质量控制成为走向国际化的阻碍[19]。因此，在以临床用药的有效性和安全性的前提下，有必要建立快速、准确、全面的多种有效成分群的检测分析方法。故本研究采用HPLC波长切换法建立了同时检测血脂灵片中23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚7种有效成分的含量方法，旨在为全面控制与评价血脂灵片的质量提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器Waters e2695型HPLC色谱仪，配备PAD二极管阵列检测器，四元梯度泵，Empower 3色谱工作站（美国Waters公司）；XS205DU型电子分析天平（瑞士-梅勒特有限公司）；KQ5200 DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli Pore Advantage A10自动纯水机（美国密理博公司）。

1.2 试剂与药物23-乙酰泽泻醇B对照品（批号：111846-201504，纯度：95.0%）、橙黄决明素对照品（批号：111900-201202，纯度：95.0%）、芦荟大黄素对照品（批号：110795-201710，纯度：98.3%）、大黄素对照品（批号：110756-201512，纯度：98.0%）、大黄酚对照品（批号：110796-201621，纯度：96.5%）、大黄素甲醚对照品（批号：110758-201013，纯度：99.8%）均购自中国食品药品检定研究院；23-乙酰泽泻醇C对照品（批号：486-66-8，纯度：98.0%）购自上海雅吉生物科技有限公司；血脂灵片共5批（批号：20190420、20190503、20190523、20190605、20190701，0.3 g/片）购自浙江天一堂有限公司；乙腈（色谱纯）购自默克公司；其他试剂（分析纯）购自天津化学试剂厂；纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Waters XBridgeTMC18柱（4.6mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱0～10 min，40%A；10～25 min，40%A→52%A；25～40 min，52%A→70%A；40～50 min，70%A；检测波长：0～36 min时在284 nm波长下检测橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚，36～44 min时在208 nm波长下检测23-乙酰泽泻醇B，45～50 min时246 nm波长下检测23-乙酰泽泻醇C；柱温：30℃；体积流量：1.0 mL/min；进样量：10 μL。

2.2 混合对照品贮备溶液的制备分别精密称取23-乙酰泽泻醇B对照品1.62 mg、23-乙酰泽泻醇C对照品1.54 mg、橙黄决明素对照品2.67 mg、芦荟大黄素对照品2.58 mg、大黄素对照品2.99 mg、大黄酚对照品2.57 mg、大黄素甲醚对照品2.08 mg分别置于同一100 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成质量浓度分别为15.39、15.09、25.37、25.36、29.30、24.80、20.76 μg/mL混合对照品贮备溶液。

2.3 供试品溶液的制备取20片血脂灵片，研成细粉，取约0.3 g，精密称定质量，置50 mL的具塞锥形瓶中，精密量取25 mL的甲醇，缓缓加入后称定总质量，水浴加热回流60 min，放冷后再称质量，补足减失的甲醇质量，摇匀，过滤。精密量取续滤液5 mL置具塞锥形瓶中，氮气吹干，加10 mL的3.5 mol/L H2SO4溶液和20 mL的CHCl3溶液，加热回流提取2 h，分取CHCl3液，水层用10 mL的CHCl3液振摇提取，合并提取液，用10 mL的水洗涤，弃去水层，CHCl3液水浴蒸干，残渣转移至容量瓶中，用甲醇-乙酸乙酯（2∶1）溶解并定容至5 mL，摇匀，过0.45 μm滤膜，即得供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备按本处方各药材用量比例及制剂工艺流程分别制备缺决明子、制何首乌药材阴性对照品，缺泽泻药材阴性对照品，再按“2.3”项下制备方法分别制备缺决明子、制何首乌药材阴性对照溶液，缺泽泻药材阴性对照溶液。

2.5 系统适用性试验精密吸取混合对照品贮备溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，按照既定的HPLC-PDA进样程序设置进样，最后记录50 min的HPLC色谱图。（见图1）结果显示，23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚7个色谱峰的分离度均良好，结果显示所建立的HPLC-PDA方法满足本次实验的测试要求。

图1 HPLC图

2.6 线性关系、定量限和检出限分别精密吸取0.25、0.50、1.25、2.50、5.00mL的23-乙酰泽泻醇B（质量浓度为15.390μg/mL）、23-乙酰泽泻醇C（质量浓度为15.090 μg/mL）、橙黄决明素（质量浓度为25.370μg/mL）、芦荟大黄素（质量浓度为25.360μg/mL）、大黄素（质量浓度为29.300 μg/mL）、大黄酚（质量浓度为24.800 μg/mL）、大黄素甲醚（质量浓度为20.760 μg/mL）混合对照品溶液，置于透明的容量瓶中，缓慢滴加甲醇溶液定容至5 mL刻度线，即可稀释制成不同质量浓度的23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品溶液，然后依次按既定的HPLC-PDA色谱条件进样10 μL定量分析，根据峰面积（A）计算各个成分的含有量。即23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚7种成分的质量（X，μg）为横坐标，其各自的峰面积积分值（Y）为纵坐标，通过计算得出各自标准曲线的回归方程与相关系数r。结果见表1，各成分的线性关系在其相应的质量浓度范围内均有良好的线性关系。以3倍的信噪比（S/N=3）得出仪器检出限和10倍的信噪比（S/N=10）得出仪器的定量限。

表1 7种化学成分线性关系、检出限和定量限

2.7 精密度试验取同一批次的血脂灵片样品1份，按照已定的样品制备和HPLC-PDA程序进样方法，连续测定6次后计算各成分的含量。23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量RSD分别为1.01%、1.06%、1.02%、1.15%、0.78%、1.23%、1.03%，表明本试验仪器的精密度良好。

2.8 稳定性试验取同一批次的血脂灵片供试品，按照已定的样品制备和HPLC-PDA程序进样方法，分别于0、2、4、6、8、12 h注入HPLC色谱仪。23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚各成分的峰面 积 的RSD为1.19%、1.02%、1.03%、0.94%、0.93%、1.12%、0.95%，表明样品溶液中的7种成分在12h内均有良好的稳定性。

2.9 重复性试验取同一批次的血脂灵片样品共6份，按照已定的样品制备和HPLC-PDA程序进样方法，分别进样分析。23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量RSD分别为1.01%、1.01%、1.13%、0.99%、0.89%、1.02%、1.05%，表明建立的方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验取同一批次（批号：20190420）的血脂灵片样品共9份，每份取约0.15 g，精密称定后分别置于50 mL锥形瓶中，每组分别加入23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品贮备液，加入量为血脂灵片样品中各成分含量的50%、100%和150%，按照已定的样品制备和HPLC-PDA程序进样方法进行色谱分析，并计算7种有效成分的加样回收率。结果显示，平均回收率分别为23-乙酰泽泻醇B为99.98%（n=9，RSD=0.86%）；23-乙 酰 泽 泻 醇C为101.29%（n=9，RSD=0.92%）；橙黄决明素为100.88%（n=9，RSD=1.10%）；芦荟大黄素为99.98%（n=9，RSD=0.92%）；大黄素为101.50%（n=9，RSD=1.63%）；大黄酚为100.19%（n=9，RSD=0.55%）；大黄素甲醚为99.95%（n=9，RSD=0.60%）。（见表2）表明建立的试验方法准确、可靠。

表2 加样回收率试验结果（n=9）

续表2：

2.11 含量测定取5个批次的血脂灵片样品，按照已定的样品制备和HPLC-PDA程序进样方法进行色谱分析，并记录50 min的色谱峰。计算23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量。（见表3）

表3 5批样品中7种化学成分含量测定结果（mg/片，n=3）

3 讨 论

3.1 测定指标成分的选择血脂灵片是在中医基础理论指导下，经过中药药剂制备工艺精心制备而成的中药复方，该方中各有效成分协同作用共同发挥疗效[20]。笔者根据制剂配伍的君臣佐使原则，选择可能发挥疗效的君药泽泻（23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C）和臣药决明子（橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚）中的7种成分为测定指标，采用HPLC-PDA法同时定量分析了各有效成分在样品中的含有量。结果显示，7种有效成分在一定的HPLC-PDA方法下分离度均良好。

3.2 样品处理方法和检测波长的优选参照2015年版《中华人民共和国药典》（一部）中血脂灵片的处理方法处理样品，结果发现该供试品溶液处理方法可使样品中23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚提取完全。23-乙酰泽泻醇B在波长208 nm处有吸收，23-乙酰泽泻醇C在波长246 nm处有吸收，橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚在波长284 nm处均有吸收。故本试验选择波长切换法同时对23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚7种有效成分的含量进行测定分析。

3.3 色谱条件的选择试验过程中分别对乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水3种流动相系统进行了对比，发现在乙腈-0.1%磷酸水流动相体系下进行梯度洗脱时，23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚7种成分之间色谱峰的分离度均大于1.5，分离效果较好；考察不同温度（25℃、30℃、35℃）及不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）对各有效成分色谱峰的分离效果，发现30℃的柱温、1.0 mL/min的流速可以达到色谱分基线平稳、分离度和峰形较好的效果；考察不同品牌色谱柱，如Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters XBridgeTMC18（4.6mm×250mm，5μm）、Thermo BDS-C18（4.6mm×250mm，5 μm），结果显示Waters XBridgeTMC18柱能将7种指标性成分，即23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的色谱峰分开，并达到了良好的分离度。

3.4 样品含量分析通过HPLC-UV波长切换法对5批血脂灵片中7种成分同时测定，结果显示不同批次之间三萜类成分和蒽醌类成分差异较小，其中23-乙酰泽泻醇B含量最低，为0.050 9～0.057 3 mg/片；23-乙酰泽泻醇C含量为0.053 5～0.058 8 mg/片；橙黄决明素含量为0.205～0.211 mg/片；芦荟大黄素含量为0.231～0.255mg/片；大黄酚含量为0.198～0.211mg/片；大黄素甲醚含量为0.209～0.228 mg/片；大黄素含量最高，为0.312～0.342 mg/片。5批样品均符合2015年版《中华人民共和国药典》（一部）中规定的血脂灵片每片含大黄素（C15H10O5）不得少于0.15 mg。

4 小 结

本研究建立了HPLC-UV法同时测定血脂灵片中23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量的方法，并对HPLC分离参数进行了一系列的方法学考察，优化得出最理想的HPLC色谱分离方法，表明本次方法同时测定血脂灵片中不同有效成分的含量，结果较为准确、可靠。本研究首次对血脂灵片君药（泽泻）和臣药（决明子）中的有效成分同时进行测定，不仅可为血脂灵片内在质量有效评价提供参考，同时也为其他中药复方制剂的质量控制与评价提供借鉴。