清热养阴除湿汤治疗胶原诱导性关节炎大鼠的血清代谢组学研究*

张 净，张阳利，尹圆圆，张林聪，郭家彬，刘密凤

（1.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；2.中国人民解放军疾病预防控制中心，北京 100071）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以炎症和骨损伤为主要特征的慢性炎症性自身免疫性疾病，全世界患病率平均为0.5%～1.0%[1]，临床表现为关节功能下降、肿胀、疼痛。RA降低了患者的生活质量，且危害患者健康。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是治疗类风湿关节炎的临床一线用药，可以有效抑制炎症，减轻骨破坏，但长期使用可能会导致严重的全身并发症，造成胃、肠、血液系统、肝、肺和中枢神经系统多器官损伤[2-6]。MTX还具有生殖系统毒性，可引起卵母细胞缺乏和精子减少，生育能力减退。另外，30%～40%的早期RA患者中，单一MTX治疗无法有效抑制炎症和降低疾病活动度，需联合使用其他缓解病情抗风湿药物（DMARD）或生物制剂[7]。因此，寻找安全有效的治疗方法是一个亟待解决的问题。

中医学认为类风湿关节炎属于“痹证”范畴。《素问·痹论篇》指出：“风、寒、湿三气杂至，合而为痹”。北京中医医院风湿科国家级老中医药专家王为兰认为，类风湿关节炎多因风寒湿邪内侵或内生湿邪，久蕴不解，化热伤阴，灼津酿毒，热毒湿浊瘀滞，痹阻经隧，致成痹热。王为兰据此创立了清热养阴除湿汤，该方由半枝莲、虎杖、金银花、连翘等组成，具有清热解毒、化浊除湿、通督止痛之功。该方最早应用于治疗类风湿关节炎急性期，后逐渐推广用于治疗强直性脊柱炎、痛风等多种风湿病急性期[8]。前期研究显示其抗炎、镇痛作用良好[9]。清热养阴除湿汤作为我院临床使用的有效方剂，其药效学机制尚不明确。代谢组学通过现代高通量分析技术对生物体内产生的代谢物进行分析，可以更好地了解并确定药物中的小分子代谢物及代谢途径。本研究利用胶原诱导性关节炎模型（collagen-induced arthritis，CIA），通过代谢组学技术寻找差异性代谢物，拟探讨清热养阴除湿汤治疗RA的药效学机制。

1 材 料

1.1 实验动物6～8周龄健康SPF级Wistar大鼠24只，雌雄各半，购于北京维通利华实验动物有限公司，实验动物使用许可证编号：SCXK（京）2016-0006，实验动物质量合格证号：1100111911046320。所有大鼠均在SPF级动物房中饲养，环境温度（24±2）℃，湿度（50±2）%，12 h周期光照，实验期间动物自由饮食水，适应性喂养1周后开始实验。实验结束后用1%戊巴比妥钠麻醉取材。动物实验方案经首都医科大学附属北京中医院伦理委员会批准。所有动物实验均按照中华人民共和国卫生部出版的《动物护理和使用指南》（1998年1月）进行。

1.2 药物与试剂清热养阴除湿汤组方中白花蛇舌草、金银花、连翘、半枝莲、虎杖、生地黄、白鲜皮、桂枝、忍冬藤、牡丹皮（报告书编号分别为：C20190627-01，C20190326-02，C20181228-01，C20190725-01，C20190703-04，C20190723-01，C20190312-02，C20190530-02，C20190412-01，C20190517-15）均由北京杏林药业有限责任公司检验；制川乌（报告书编号：DX-C2019081901）由北京华邈药业有限公司检验；土茯苓（报告书编号：C201805023）由北京太洋树康中药饮片厂检验，均符合2015年版《中华人民共和国药典》规定标准。中药材统一由首都医科大学附属北京中医医院中药房提供，以中药煎煮机统一制成煎剂；甲氨蝶呤（MTX）（上海上药信谊药厂有限公司，批号：H31020644）；弗氏不完全佐剂（批号：7002）、牛Ⅱ型胶原（批号：20022）均购自美国Chondrex.Inc公司；甲醇（批号：67-56-1）、乙腈（批号：75-05-8）均购自美国Thermo公司；甲酸（日本TCI公司，批号：64-18-6）；甲酸铵（美国Sigma公司，批号：540-69-2）；L-缬氨酸（批号：81201-85-6）、L-苯丙氨酸（批号：81201-86-7）、尿嘧啶（批号：35803-45-3）、D-果糖（批号：108311-21-3）、维生素B3（批号：66148-15-0）、氯化胆碱（批号：61037-86-3）均购自美国CIL公司；N-（Carboxymethyl)-N,N,N-trimethyl-d9-ammonium Chloride（批号：285979-85-3）、L-carnitine-d3 HCl（批号：350818-62-1）均购自加拿大CDN公司。

1.3 主要仪器UltiMate 3000液相色谱仪（美国Thermo公司）；Q Exactive型质谱仪（美国Thermo公司）；H1850-R型冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；QL-866型混匀仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；5305型真空浓缩仪（德国Eppendorf公司）；FSH-2A型高速匀浆机（常州市亿能实验仪器厂）。

2 方 法

2.1 CIA大鼠模型制备参照文献[10]建立大鼠CIA模型。将等体积的牛Ⅱ型胶原溶液和不完全弗氏佐剂在冰浴上用高速匀浆机（15 000 r/min）充分混匀制备乳剂，浓度为1 mg/mL，并于制备后1 h内使用。将大鼠分为造模组和对照组。造模组大鼠尾部皮下注射0.2 mL乳剂进行初次免疫，7 d后继续注射0.1 mL乳剂加强免疫。对照组大鼠相同部位注射等量生理盐水。大鼠致敏后第7天开始，每周观察大鼠四肢关节病变程度，进行关节炎指数评价。根据病变程度累计积分，按5级评分方法计算关节炎指数。评分标准如下，0分：正常；1分：小趾红肿；2分：趾关节和足跖肿胀；3分：踝关节以下足爪肿胀；4分：包括踝关节在内的全部足爪肿胀。将各个关节的积分累计得出每只大鼠的关节炎指数[10]。初次免疫14 d后，关节炎指数〉4分的大鼠视为造模成功。

2.2 分组及给药造模成功的大鼠采用随机数字表法随机分为模型组、甲氨蝶呤组和清热养阴除湿汤组，每组6只。另选取6只大鼠作为对照组。对照组和模型组大鼠给予生理盐水灌胃，10 mL/kg，1次/d，连续5周。清热养阴除湿汤组大鼠给予清热养阴除湿汤剂灌胃，17 g/kg，1次/d，连续5周。甲氨蝶呤组大鼠给予甲氨蝶呤片溶液灌胃，0.625 mg/kg，2次/周，连续5周。药物干预5周后，1%戊巴比妥钠麻醉大鼠后腹主动脉取血，离心分离并提取上层血清，-80℃保存待测。

2.3 代谢物提取[11]取100 μL大鼠血清样本至2 mL离心管中；加入100 μL内标混标和400 μL甲醇，涡旋振荡1 min；4℃12 000 r/min离心10 min，取上清液500 μL至2 mL离心管中真空浓缩干燥；加入150 μL 80%甲醇溶液复溶，充分混匀后4℃12 000 r/min再次离心10 min，取上清液作为待测样本。

2.4 色谱条件[12]使用ACQUITY UPLCRHSS T3（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）色谱柱，自动进样器温度设为8℃，流速为0.25 mL/min，柱温为40℃，进样体积为2 μL。程序设置为梯度洗脱，流动相为正离子0.1%甲酸水（C）-0.1%甲酸乙腈（D）；负离子5mmol/L甲酸铵水（A）-乙腈（B）。梯度洗脱程序为0～1 min，2% B/D；1～9 min，2%～50% B/D；9～12 min，50%～98% B/D；12～13.5 min，98% B/D；13.5～14 min，98%～2% B/D；14～20 min，2% D-正模式（14～17 min，2% B-负模式）。

2.5 质谱条件[12]仪器使用Thermo Q Exactive，电喷雾离子源（ESI），正负离子电离模式，正离子喷雾电压为3.50 kV，负离子喷雾电压为2.50 kV，鞘气为30 arb，辅助气为10 arb。毛细管温度为325℃，以分辨率为70 000进行全扫描，扫描范围81～1 000，并采用HCD进行二级裂解，碰撞电压为30 eV，同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息。

2.6 数据处理与统计学分析代谢组学数据经Proteowizard软件（v3.0.8789）将原始数据转换成mzXML格式，并采用R（v3.3.2）的XCMS程序包对上述数据进行过滤及归一化[13]。使用SIMCA-P（v13.0）（Umetrics，Umea，Sweden）进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）)和正交-偏最小二乘判别（OPLS-DA）分析[14]。筛选OPLS-DA分析中VIP值≥1.0，且组间差异有统计学意义（P≤0.05）的化合物，通过METLIN数据库（http://metlin.scripps.edu）鉴定代谢物，Metabo Analyst软件进行代谢通路分析[15]。计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，采用SPSS 21.0软件对数据进行Kruskal-Wallis H检验及多重比较分析，P〈0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 大鼠血清代谢物分析采用LC-MS/MS技术对4组大鼠血清样品进行检测。质量控制（quality control，QC）样品中的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）〈30%的特征峰比例均达到70%以上，说明数据良好[16]。（见图1）经色谱分离流出的组分不断进入质谱，质谱连续扫描进行数据采集。每一次扫描得到一张质谱图，将每一张色谱图中各个时刻点选择谱图中最强的离子连续描绘，以离子强度为纵坐标，时间为横坐标，得到基峰色谱图（Base peak chromatogram，BPC）。正负离子模式下各组大鼠血清的基峰图见图2。正离子模式获得7 416个前体分子（precursor molecule），负离子模式获得5 594个前体分子。基峰色谱图显示4组大鼠之间代谢产物存在明显差异。

图1 质量保证结果图

图2 正离子（A）和负离子（B）模式下各组大鼠血清样品基峰图

3.2 潜在生物标志物的鉴定对各组采集的多维数据进行统计分析、数据建模及差异代谢物筛选。选取OPLS-DA模型中投影重要度（VIP）≥1.0，且Kruskal-Wallis检验（P≤0.05）的变量为差异代谢物，对不同组别差异代谢物进行筛选。与对照组比较，模型组中（R）-3-羟基丁酸、硫酸盐、L-丝氨酸、胸腺嘧啶、N-甲基酪胺、嘧啶二氮艹卓、13-L-氢过氧化亚油酸、共轭亚油酸、抗坏血酸、L-苹果酸、3-羟基邻氨基苯甲酸酯、肌醇、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、1，6-二磷酸果糖等14种差异代谢物上调，豆蔻酸、琥珀酸、5-羟基吲哚乙酸3种差异代谢物下调。清热养阴除湿汤可下调（R）-3-羟基丁酸、L-丝氨酸、嘧啶二氮艹卓、抗坏血酸、L-苹果酸、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、1，6-二磷酸果糖水平；甲氨蝶呤可下调L-丝氨酸、共轭亚油酸、抗坏血酸、L-苹果酸水平。其中L-丝氨酸、抗坏血酸、L-苹果酸为清热养阴除湿汤和甲氨蝶呤共有的差异代谢物。（见表1）

表1 各组大鼠血清潜在差异代谢物分析

3.3 代谢通路分析借助MetaboAnalyst 4.0（http://www.metaboanalyst.ca/）数据库对鉴别出的潜在生物标志物进行代谢通路富集分析。在KEGG数据库中，根据-log（P）〉0.5且Pathway impact〉0.1筛选出9条与RA最为相关的代谢通路，包括癌症、肾癌、AMPK信号通路、氧化磷酸化、亚油酸代谢、硫代谢、甘氨酸-丝氨酸和苏氨酸代谢、丁酸代谢、酮体合成和降解。各条代谢通路对应的代谢物见表2。甲氨蝶呤和清热养阴除湿汤干预与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，氧化磷酸化，丁酸代谢，癌症途径，以及肾细胞癌5种代谢途径有关。此外，MTX干预还可引起亚油酸代谢、硫代谢途径改变；清热养阴除湿汤可引起AMPK信号通路、酮体的合成与降解代谢途径改变。（见图3～5）清热养阴除湿汤和甲氨蝶呤干预存在5种不同的差异代谢物[主要包括（R）-3-羟基丁酸、嘧啶二氮艹卓、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、1，6-二磷酸果糖、共轭亚油酸]和4条差异代谢通路（包括AMPK信号通路、亚油酸代谢、硫代谢和酮体合成和降解）。

图3 代谢通路影响因子柱状图（模型组VS对照组）

表2 大鼠差异代谢物通路分析

图4 代谢通路影响因子柱状图（甲氨蝶呤组VS模型组）

图5 代谢通路影响因子柱状图（清热养阴除湿汤组VS模型组）

4 讨 论

RA的主要特征是滑膜关节的慢性炎症和关节软骨破坏[17]。遗传易感性、环境因素触发的针对滑膜和软骨成分的致病性自身免疫炎症反应，以及免疫炎症细胞浸润并诱导滑膜细胞向自主增殖细胞转化、炎症细胞因子生成失调是引发RA的主要因素[18-19]。这些因素提示，细胞因子介导的炎症过程在RA进程中具有重要作用，并且这种炎症过程能够引起新陈代谢改变[20-21]。代谢途径对单细胞和多细胞生物的发育具有深远影响。代谢物通过抗原受体和共刺激分子、生长因子、激素、细胞因子、环境因子和其他调节信号等机制影响免疫系统发育。先天性和适应性免疫系统中细胞的异质性取决于代谢物的供应。代谢组学技术与高通量、高分辨率分析技术和多元数据分析方法相结合，通过建立代谢物含量变化与生物表型变化之间的关系，可揭示疾病发生和发展的代谢机制[22]，广泛用于复方中药的机制研究。CIA模型是一种经典的临床前模型，与人类RA的发病机制最为相似[23]。为了解清热养阴除湿汤治疗类风湿关节炎的代谢机制，本研究以CIA大鼠为模型，利用血清代谢组学方法探讨了清热养阴除湿汤治疗CIA大鼠后差异代谢物和代谢通路的变化。

本研究结果表明，与对照组比较，模型组大鼠存在17种差异代谢物（P〈0.05），涉及9条代谢通路（P〈0.05）。清热养阴除湿汤可下调（R）-3-羟基丁酸、L-丝氨酸、嘧啶二氮艹卓、抗坏血酸、L-苹果酸、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、1，6-二磷酸果糖等7种差异代谢物水平（P〈0.05），涉及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，氧化磷酸化，丁酸代谢，癌症途径，肾细胞癌，AMPK信号通路，以及酮体合成和降解7种代谢途径（P〈0.05）。丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸参与蛋白质、核酸、脂质等生物大分子合成，有助于免疫球蛋白和抗体的产生，参与免疫和抗炎、抗氧化功能[24-27]。L-丝氨酸是甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢的中间产物，清热养阴除湿汤治疗后L-丝氨酸水平下降，提示清热养阴除湿汤可能通过调节丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸代谢通路治疗RA。酮体的新陈代谢是生理动态平衡的中心节点，是炎症和氧化应激调节剂，在细胞代谢、体内稳态和信号传导中具有重要作用[28-29]。（R）-3-羟基丁酸是酮途径的代谢产物，可以恢复能量代谢、改变氧化还原状态[30]。清热养阴除湿汤治疗后（R）-3-羟基丁酸水平降低，提示清热养阴除湿汤可通过调节酮体合成和降解治疗RA。此外，（R）-3-羟基丁酸也是丁酸代谢通路中的代谢物，调节丁酸代谢可以增强机体免疫力，抑制炎症反应[31]。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）是一种AMP依赖性蛋白激酶，是生物能量代谢调节的关键分子，参与机体的多种代谢反应过程。当机体出现多种应激反应状况时，如缺氧、缺乏营养物质或者在运动过程中时，AMP/ATP比值升高，AMPK激活从而启动AMPK激活酶系统，关闭ATP损耗路径和同时开启产生途径，所以AMPK信号通路又被称为“细胞能量监测器”[32]。在低ATP条件下，AMPK被招募到溶酶体的细胞质表面，并阻断mTOR复合物1（mammalian target of rapamycin complex1,mTORC1）激活，促进分解代谢途径，导致细胞生长减缓和蛋白质合成减少[33-34]。AMPK还可以通过调控下游靶点乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACC）调控脂肪酸的合成过程。AMPK信号通路通过调控细胞能量代谢过程而影响宿主对病原体感染的防御机制[32，35-36]。AMPK的激活可以抑制JAK-STAT依赖的信号通路，这也是RA相关事件的主要原因[37]。由于能量传感器AMPK障碍[38]，RA-T细胞在平衡分解代谢和合成代谢方面存在缺陷，并偏离了细胞构建程序。

1，6-二磷酸果糖（Fructose 1,6-bisphosphate，FBP）是细胞糖酵解过程的一种内源性中间体，由6-磷酸果糖磷酸化而产生，是葡萄糖氧化过程中的重要调节点[39]。1，6-二磷酸果糖含量变化提示CIA大鼠糖酵解作用增强。糖酵解分解中的关键事件是通过6-磷酸果糖-1-激酶（PFK1）将6-磷酸果糖磷酸化为1,6-二磷酸果糖，这是一种不可逆的反应，使葡萄糖参与糖酵解。PFKFB3对糖酵解速率起着关键性的调节作用。RA-T细胞在活化后不能上调PFKFB3，可抑制糖酵解分解并限制丙酮酸/乳酸的产生[40-41]。相反，RA-T细胞转录上调葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD）后，可将葡萄糖转移到磷酸戊糖途径（PPP）。PFK/G6PD平衡失调导致NADPH过量产生和还原型谷胱甘肽的积累，从而形成一个还原性的细胞内环境[42-43]。这种氧化还原稳态的根本性改变明显干扰了对能量状态的正确感知。因此，这种代谢适应不是T细胞适应炎症组织环境的结果。相反，其是T细胞侵入周围组织，定植并驱动相应部位炎症的途径，是代谢重编程的结果之一。T细胞适应性的关键因素是它们对细胞内能量资源和代谢活性的高效感应[44]。RA患者存在糖代谢异常、胰岛素抵抗，多种糖酵解酶活性增强可能与RA的发病机制密切相关[45]。T细胞将葡萄糖从糖酵解分解中转移到戊糖磷酸途径，以提供生物合成前体，并上调脂肪生成，从而实现细胞运动性和组织侵袭性。RA患者T细胞显示出独特的代谢特征，其代谢异常都与异常细胞行为有关。RA患者代谢异常可影响原始CD4+T细胞群，是导致RA患者自身耐受性丧失的可能初始因素之一。T细胞出现线粒体功能缺陷后，由于线粒体DNA修复不足，导致线粒体耗氧量低，ATP生成受损。受损的线粒体DNA逃逸到细胞质中，被认为是一种危险相关分子模式（danger associated molecular pattern，DAMP）。炎症小体的组装和Caspase-1的激活可导致T细胞焦亡，并引发强烈的组织炎症。细胞代谢在促进免疫细胞功能中起着不可或缺的作用。T细胞自身免疫效应功能依赖于细胞能量的特定代谢途径。清热养阴除湿汤可能通过调节FBP和AMPK信号通路来调整和恢复T细胞紊乱的能量代谢、生物合成及氧化还原状态，可以使其从慢性炎症状态恢复到正常稳态，从而减轻炎症反应缓解疾病。