光周期对雄性哺乳动物季节性精子发生的影响及其调控机制

杨 笛 陈婉依 宫泽儒 杨 明

(沈阳师范大学生命科学学院，沈阳，110034)

季节性繁殖是哺乳动物适应环境变化的一种策略，以最大限度地提高繁殖成功率。当周围环境发生变化，如气温或食物供应等不再适宜动物的生长发育，会使动物的繁殖成功率显著降低。光照周期是季节性繁殖的主要影响因子，也是动物预测未来环境变化的信号[1]。按照动物对不同季节日照周期长短的生殖反应差异，大致分为长日照繁殖和短日照繁殖。长日照繁殖的哺乳动物如小毛足鼠(Phodopusroborovskii)等，在春季日照时间逐渐延长的情况下发情并交配[2]；短日照繁殖的哺乳动物如绵羊(Ovisaries)等，随着日照逐渐变短而进入生殖期，交配发生在秋季，幼崽出生在食物充足的春天[3]。

季节性繁殖的物种，雌性和雄性哺乳动物的繁殖策略不同。雌性哺乳动物的季节性繁殖策略主要是保证后代在食物资源丰富的季节出生，排卵后受孕及胚胎的发育情况是影响其生殖能力的关键。雄性哺乳动物的季节性繁殖策略是在繁殖期产生成熟的精子并成功交配，生殖能力与精子发生、性欲强弱以及交配能力等因素有关，其中精子发生对物种繁殖和延续非常重要。精子发生过程中，精原细胞的分裂和分化、精母细胞减数分裂及精子细胞变态等任何一个步骤的停滞，都无法产生成熟的精子，使最终的生殖水平下降[4-5]。

光周期是调节精子发生的主要环境因子[6]。季节性精子发生受控于精原细胞分化水平，繁殖期的雄性动物睾丸生精小管除支持细胞外，还含有精原细胞、精母细胞和精子细胞并具有明显的管腔，附睾内有精子。非繁殖季节，高原鼢鼠(Eospalaxbaileyi)和长毛犰狳(Chaetophractusvillosus)的生精小管主要含有支持细胞和精原细胞[7-8]，高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)和高原鼢鼠中还可见未分化型的精原细胞[7，9]，金色中仓鼠(Mesocricetusauratus)和伊比利亚鼹鼠(Talpaoccidentalis)的精子发生停滞在精母细胞阶段[10-11]，大林姬鼠(Apodemusspeciosus)生精小管内只有精原细胞和大量凋亡的精母细胞[5]。

睾丸生精细胞的季节性变化是在复杂的神经和体液调节下实现的，褪黑激素介导的TSH-DIO2/DIO3-T3通路[1]和HPG轴—睾酮—视黄酸通路[9]可能是光周期调节季节性精子发生的主要机制。本文从光周期对繁殖的影响出发，分析雄性哺乳动物季节性繁殖的生理机制及其调节通路，了解季节性繁殖的发展规律，为动物的人工繁殖提供参考和支持。

1 光周期对哺乳动物繁殖的影响

光周期是许多野生啮齿动物(Rodent)季节性繁殖的重要同步因子[12]。长日照繁殖动物如长尾小囊鼠(Perognathusformosus)和长爪沙鼠(Merionesunguiculatus)，在长光周期下雄性的睾丸发育和恢复受到刺激，睾丸质量明显增加，睾丸体积和生精小管直径更大；但在短光周期下表现出明显的性腺退化，睾丸的发育和恢复受到抑制，生殖上皮细胞耗竭，生精小管直径减小，随后睾丸缩小繁殖停止，避免不利环境对其后代的影响[12-13]。短日照繁殖动物则表现为相反的变化，如和田羊在长日照条件下，睾丸表皮皱缩，生精小管之间界限明显，管壁较薄且细胞层数少[14]。

许多对光周期敏感的哺乳动物都表现出明显的睾丸大小与体内激素水平的年度周期变化。在器官水平上，与繁殖活跃的雄性相比，非繁殖期的雄性高原鼠兔的睾丸和附睾都明显变小[9]；在激素水平上，季节性繁殖的哺乳动物在繁殖期血清褪黑激素含量下降，促性腺激素释放激素(GnRH)、黄体生成素(LH)、睾酮含量显著上升，非繁殖季节显著下降[7]，如延长光照时间或增加光照强度会导致雄性金色中仓鼠睾酮含量显著上升[15]；内蒙古绒山羊血清褪黑素和睾酮随着光照周期的变化呈现季节性周期变化，短日照条件下褪黑激素和睾酮含量升高，长日照条件下变化则相反[16]。对季节性繁殖物种的研究表明，雄激素分泌的减少可能是导致季节性生殖细胞耗竭的激素信号[8]。

2 光周期影响繁殖的调控机制

2.1 光周期影响松果体褪黑激素的合成和分泌

哺乳动物季节性繁殖内在机制的研究主要集中在光周期调节通路上[17]，环境光周期信息会通过视网膜—视交叉上核(SCN)—松果体机制，调节动物的生理功能，即光周期信号通过视网膜感光细胞转化为电信号，传入视交叉上核的自主神经节细胞，通过多突触连接传递到松果体中，松果体细胞合成和释放褪黑激素的节律性形式将日照的长度变化转为内分泌信号，启动对繁殖活动的调控[3，17](图1A)。在黑暗时段褪黑激素的合成和分泌增加，明亮的条件会抑制褪黑激素的分泌。因此，褪黑激素分泌的持续时间反映了日照时间和年光照周期的变化，但是物种之间的差异较大[18]。褪黑激素对不同动物繁殖产生的作用并不一定完全相同，在长日照动物中，褪黑激素会抑制繁殖，而在短日照动物中会对繁殖产生促进作用。也有些动物对日照的变化不敏感，褪黑激素对繁殖无作用[19]。

2.2 褪黑激素通过HPG轴影响季节性繁殖

褪黑激素通过下丘脑—垂体—性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG)轴调节性腺生成配子、合成性腺激素[18]。光周期引起高原鼠兔松果体分泌褪黑激素传递到HPG轴，对繁殖期的高原鼠兔注射褪黑激素会引起睾丸质量下降，生精小管管腔缩小；对非繁殖期高原鼠兔注射褪黑激素受体拮抗剂，睾丸质量显著增加，生精小管内可见各级生精细胞，精子发生恢复[20]。可见，褪黑激素能使长日照繁殖的雄性哺乳动物的生殖功能受到抑制。褪黑激素对短日照繁殖动物的作用与长日照动物相反，公羊在非繁殖季节春季和夏季松果体释放的褪黑激素减少，精液质量和生育能力下降，这与下丘脑—垂体—睾丸轴的活动减少有关[16]。非繁殖季节给予外源性褪黑激素，可以逆转公羊的激素水平，导致睾酮、雌二醇(E2)水平升高[21]，增加精子发生和提高生育能力[14，22]，表明褪黑激素是短日照动物繁殖的活性因子。

2.3 TSH-DIO2/DIO3-T3通路

褪黑激素可作用在垂体结节部促甲状腺激素(TSH)细胞介导光周期信号，使TSH细胞产生季节性二相性转变，改变促甲状腺激素β(TSHβ)合成和分泌[23]。TSHβ通过逆行通路，作用于第三脑室内侧室管膜伸长细胞的TSH受体(TSHR)，刺激垂体TSH细胞分泌TSH[24]。在长光周期下眼缺失基因3 (eyes absent 3，Eya3)表达增高，合成TSHβ[25]。对黑线仓鼠(Cricetulusbarabensis)的研究表明，TSHβ/TSHR与季节性繁殖有关，在长日照条件下，促进TSHβ/TSHR表达，短日照条件下抑制TSHβ/TSHR表达，外源注射褪黑激素也会抑制TSHβ/TSHR表达，并发生性腺退化，褪黑激素可能通过抑制TSHβ/TSHR系统来抑制黑线仓鼠的繁殖活动[26]。但对小鼠的研究表明，注射褪黑激素会诱导TSHβ的mRNA表达增加[27]。

TSH逆行与下丘脑第三脑室内侧的室管膜伸长细胞的TSHR结合，刺激伸长细胞的旁分泌[24]，从而调节脱碘酶的表达。研究表明，光周期引起的脱碘酶变化调节了下丘脑甲状腺激素的生物活性和有效性，在长光周期中，脱碘酶Ⅱ(DIO2)基因表达上调，DIO2使四碘甲腺原氨酸(T4)脱碘产生活性更高的三碘甲腺原氨酸(T3)，下丘脑局部T3水平提高(图1B)；当处于短光周期时，DIO2表达下调，脱碘酶Ⅲ(DIO3)表达上调，静脉注射TSH也会诱导室管膜细胞中的DIO2表达并降低DIO3表达[28]，DIO3的作用是使T3分解失活，下丘脑局部T3水平下降[29]。褪黑激素产生类似非繁殖期短光照的效果，导致鼠类的体质量下降、性腺抑制，如外源注射褪黑激素抑制布氏田鼠(Lasiopodomysbrandtii)的体质量和性腺发育，同时上调Dio3基因的表达[30]，说明褪黑激素信号是 TSH-DIO-T3级联反应的主要调节因子。

2.4 T3通过HPG轴调节睾酮的分泌

T3是下丘脑GnRH脉冲分泌的有效调节因子之一[1，29]，下丘脑注射T3可以防止短日照条件下的西伯利亚仓鼠(Phodopussungorus)性腺退化和体质量减轻[31]。在GnRH刺激下，垂体产生并分泌的FSH和LH进入血液循环，前者对精原细胞的分化和增殖具有重要的作用，而后者作用于睾丸间质细胞分泌雄激素[5]，通过多种类固醇激素合成酶的持续影响，最终将游离的胆固醇逐步转化形成睾酮[32](图1C)。睾酮进入靶细胞内可直接或转化为双氢睾酮后与雄激素受体结合，作用于支持细胞和睾丸肌样细胞来保证生精小管正常生长发育[33]。雄激素受体存在于间质细胞、支持细胞、肌样细胞和血管壁平滑肌细胞，在睾丸的支持细胞中敲除雄激素受体会导致生精小管结构破坏、紧密连接消失以及精原干细胞减少[33]。睾酮在维持雄性生殖器官以及第二性征的发育中具有重要作用，有利于精子生成，使雄性动物保持较高的繁殖能力[32]。

2.5 睾酮对睾丸退化的影响

季节性繁殖使哺乳动物睾丸的结构和功能也发生变化[11]，在对伊比利亚鼹鼠和长毛犰狳的研究中发现，当睾丸内睾酮水平下降，支持细胞和生殖细胞之间的细胞黏附分子丧失，使非凋亡的减数分裂细胞和生殖细胞大量脱落[8，11]，如生精上皮中的β-连环蛋白(β-catenin)和钙黏蛋白(E-cadherin)是胞质特化结构和其他支持细胞黏附的多蛋白复合物的组成部分，非繁殖期表达降低，使生殖细胞与生精小管分离，导致睾丸缩小退化[34]，这些分子的表达可能在控制季节性繁殖的机制中发挥重要作用。

支持细胞之间通过紧密连接形成稳定结构，并与基部外胞质特殊结构和细胞桥粒连接共同构成血睾屏障(blood-testis barrier，BTB)，既保证生精细胞在生精小管内迁移方向的正确性，又将减数分裂的生殖细胞抗原与体循环分离，为精子发生提供特殊的免疫屏障[35]。在哺乳动物的繁殖期，初级精母细胞必须通过BTB才能进入减数分裂的腔室，有效调控各级生精细胞不断地由生精小管基底部向管腔的迁移[34]；而非繁殖期BTB丧失屏障功能，生殖细胞发育和分化通常会失败[36]，使有害物质渗透到达生精上皮的腔室[11，37]。这种功能的丧失与参与紧密连接形成的细胞黏附蛋白的重组有关，其中Claudin-11(Cldn11)蛋白仅在支持细胞中表达，在非繁殖期的成年仓鼠和伊比利亚鼹鼠退化的睾丸中分布异常，Cldn11的mRNA在仓鼠中的表达增加[37]，在伊比利亚鼹鼠体内的表达显著降低[11]。

支持细胞之间紧密连接形成的BTB破损，发生渗透作用，脱落的生殖细胞透过BTB，由附睾和尿道排出体外或通过凋亡而死亡[8，11]。细胞凋亡(细胞程序性死亡)是介导季节性睾丸退化的主要过程[5，38-39]。细胞凋亡能够保护雄配子的遗传完整性，以及精原细胞和精母细胞周期的同步性，并清除受损、患病或多余的细胞[40]；伊比利亚鼹鼠凋亡以季节依赖的方式变化，在非繁殖期主要影响偶线期精母细胞，但不影响支持细胞[11]。金色中仓鼠生殖细胞凋亡率在睾丸退化期间达到峰值[10]，凋亡的生殖细胞被支持细胞吞噬[4]。

3 视黄酸对繁殖的调控机制

3.1 视黄酸对繁殖的影响

光周期是影响植被类型的重要因子，光周期引起季节变化直接导致环境中动物的食物资源发生变化[41]。哺乳动物自身不能合成维生素A，只能通过食物获得，啮齿类动物如果日常维生素A摄入不足，很难完成睾丸生精小管中精原细胞的分化[42]。视黄酸是维生素A在体内的代谢产物，维生素A又名视黄醇，能在一定程度上提高精原细胞分化，促进精母细胞的减数分裂以及完成精子变形等[43]。高原鼠兔视黄酸缺失的典型症状表现为精子发生停止在尚未分化的精原细胞阶段，注射视黄酸后精子发生恢复正常[9]。季节性繁殖的动物进入非繁殖时期，视黄酸的合成效率会处于较低的水平，精原细胞的分化也会受到一定影响，导致精子发生的过程中断。促进精原细胞分化的视黄酸是由支持细胞合成的，一方面通过调节血睾丸屏障维持生精上皮完整性[44]，另一方面控制周期性的精原细胞分裂和生殖细胞分化[42，45]。

3.2 视黄酸代谢途径

血浆中的维生素A与生精细胞中的维生素A结合蛋白相结合形成复合物，该复合物与细胞膜上的视黄酸激活基因6(STRA6)结合进入到细胞内部。维生素A必须转化为视黄酸才能对繁殖进行调控，维生素A先在乙醇脱氢酶和视黄醇脱氢酶的共同作用下转变为视黄醛，再经过视黄醛脱氢酶的催化形成视黄酸，细胞质内的视黄酸与视黄酸结合蛋白(cellular RA binding protein，CRBP)相结合进入到细胞核中，与其核受体结合形成异源二聚体，启动靶基因的转录表达而发挥作用[46-47](图1D)。视黄酸的降解也至关重要，由细胞色素P450 26系酶降解失活[48]。

图1 光周期通过褪黑激素和视黄酸对繁殖的调控通路[1，7，9，47]Fig.1 Photoperiod regulates reproduction through melatonin and retinoic acid[1，7，9，47] 注：SCN.视交叉上核；3v.第三脑室；TSH.促甲状腺激素；TSHR.促甲状腺激素受体；DIO2.脱碘酶Ⅱ；T4.四碘甲腺原氨酸；T3.三碘甲腺原氨酸；GnRH.促性腺激素释放激素；FSH.卵泡刺激素；LH.黄体生成素；T.睾酮；ROL.视黄醇；RBP4.视黄醇结合蛋白；STRA6.视黄酸激活基因6；RDH.视黄醇脱氢酶；ADH.乙醇脱氢酶；RAL.视黄醛；RALDH.视黄醛脱氢酶；RA.视黄酸；RAR.视黄酸受体；RXR.视黄酸X受体 Note：SCN，Suprachiasmatic nuclei.3v，Third ventricle.TSH，Thyroid-stimulating hormone.TSHR，TSH receptor.DIO2，Deiodinase type 2.T4，Thyroxine.T3，Triiodothyronine.GnRH，Gonadotrophin-releasing hormone.FSH，Follicle-stimulating hormone.LH，Luteinising hormone.T，Testosterone.ROL，Retinol.RBP4，Retinol-binding protein.STRA6，Stimulated by retinoic acid gene 6.RDH，Retinol dehydrogenases.ADH，Alcohol dehydrogenases.RAL，Retinal.RALDH，Retinal dehydrogenases.RA，Retinoic acid.RAR，Retinoic acid receptor.RXR，Retinoic acid receptor

3.3 睾酮—视黄酸信号调控季节性精子发生

类固醇生成功能和配子发生功能在许多动物中都表现出季节性节律[6，45]。对睾丸的转录组学研究结果表明，类固醇激素生物合成和视黄醇代谢均为与繁殖有关的显著富集的代谢途径[9]，精原细胞分化的关键诱导因子视黄酸水平及其调控基因表达均呈季节性变化[7]。外源注射睾酮通过调节视黄酸合成酶和降解酶的表达直接影响视黄酸水平[7，9]。非繁殖期高原鼠兔注射睾酮会使视黄酸合成酶的关键基因表达上调，降解酶则表达下调，全反式视黄酸(ATRA)水平显著提高[9](图1E)。非繁殖期雄性高原鼠兔和高原鼢鼠的睾酮浓度低，精原细胞分化过程受阻[7，9，49]。当睾酮的浓度很高时，提高视黄酸的合成速率，抑制视黄酸的降解，使视黄酸达到细胞分化所需要的浓度[9]。低剂量的睾酮可以维持生殖细胞生存，高剂量的睾酮调控精子发生和动物的繁殖行为[7，50]。给非繁殖期的雄性高原鼠兔注射睾酮或视黄酸，睾丸质量显著增加，生殖细胞数量增加，大多数生精小管中观察到完整的精子发生，附睾内有精子[9]。睾酮和视黄酸对非繁殖期雄性动物性腺恢复的效果不同，在非繁殖期给高原鼢鼠注射视黄酸，可提高精原细胞分化能力，促进精子发生的恢复；注射睾酮使高原鼢鼠睾丸质量显著增加，精原细胞分化启动[7]，表明睾酮—视黄酸信号是调控繁殖活动和生殖细胞发育的关键途径。

4 结语

光照周期的变化一方面引起松果体分泌褪黑激素改变作用于垂体结节部细胞，经过THS-DIO2/DIO3-T3逆行通路以及下丘脑—垂体—性腺轴起作用，调节季节性繁殖的雄性哺乳动物的性腺变化、繁殖相关激素的分泌以及精子发生过程；另一方面通过影响植被间接影响动物所摄取的食物资源来启动或抑制繁殖。哺乳动物季节性繁殖受到光周期的影响，但繁殖策略各有不同，受到多种激素的调控，激素之间如何协调启动繁殖的机理有望进一步解析。高通量测序技术在季节性发情中的应用，可以更深入地了解繁殖的内在分子机制，为研究野生动物季节性繁殖节律提供指导依据。