不同处理方法对金槐5种黄酮类成分含量的影响研究*

苏鑫宇，朱成豪，邹 蓉，唐健民，蒋运生，陈 莹，郭怡博，孙志蓉

（1.北京中医药大学中药学院，北京 102488；2.广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西 桂林 541006）

槐米为豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花蕾，具有凉血止血、清肝泻火等功效[1]。金槐Sophora japonica cv.jinhuai是国槐树种经不断矮化嫁接培育出的新品种。金槐槐米（下文简称金槐）主产于中国桂北和湘南地区，相比于需要8年才能采收槐米的国槐实生树，金槐具有生产周期短、易采收及产量高的特点[2]。目前，对金槐质量评价多以芦丁含量为指标。已有研究[3]发现金槐中芦丁含量明显高于其他国槐树种，而中药发挥药效往往是多成分、多靶点协同作用，以芦丁单一成分对金槐进行质量评价不够全面。此外，化学成分研究[4-8]表明金槐中还有水仙苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素等其他黄酮类成分，具有抗氧化、抗癌、保护心脑血管等作用。目前已有研究[9-11]建立了HPLC法同时测定国槐槐米的芦丁、槲皮素和水仙苷等几种药效成分的含量，但测定的成分种类和数量不一，色谱分析条件各不相同，故亟需建立适用于金槐的黄酮类成分含量测定方法。

中药材品质除受内在种质直接影响，还与其种植、采收、加工等环节息息相关[12]。有研究[13]表明药用植物随着生长年限的增长其次生代谢成分含量呈现不同程度的变化。金槐在生长4～10年甚至更长年限均可采收，目前对于不同生长年限栽培金槐的黄酮类次生成分变化的报道较少。另外，研究[14-15]发现不同干燥方式及温度直接影响药材的药效成分和饮片性状等相关品质。金槐在生产中初加工方式不一，有蒸后晒干或直接晒干。已有研究[16]发现金槐在干燥前经蒸汽杀青后芦丁含量相对较高，但对于金槐杀青后烘干和直接烘干处理的其他黄酮类成分含量比较的研究较少。故本研究首先对金槐中5种黄酮类成分芦丁、水仙苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素的提取和含量测定方法进行优化，建立同时测定金槐中5种黄酮类成分含量的HPLC测定方法，再进一步比较不同干燥方法、不同生长年限、不同品种金槐中5种黄酮类成分含量的变化，为金槐的质量监测提供方法参考，同时为金槐的干燥加工方式提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 主要仪器LC-20AT型高效液相色谱仪，配备DAD检测器（日本岛津公司）；YCD-EL260型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；SP-742D型高速粉碎机（广州市兆利电器实业有限公司）；KQ-500DE型数控超声清洗器（南北仪器有限公司）；Sartorius BSA124S型十万分之一电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 试剂芦丁标准品（批号：A05GB144263）、水仙苷标准品（批号：A05GB144092）、槲皮素标准品（批号：C28J11Y116820）、山奈酚标准品（批号：G03J11L117305）和异鼠李素标准品（批号：J30GB154008）均购自上海源叶生物科技有限公司；色谱级甲醇（Thermo Fisher Scientific公司）；水为娃哈哈，其他试剂为分析纯。

1.3 样品采集和处理2021年7月中下旬，于中国桂北地区选择J2（Sophora japonica L.cv.jinhuai J2）和J3（Sophora japonica L.cv.jinhuai J3）（由国家林业和草原局授予广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所植物新品种权）两种金槐品种（嫁接树），根据地径大小分别采集不同生长年限植株的成熟花枝，并邀请广西植物研究所蒋运生研究员进行品种鉴定。每个金槐产区选择5株生长年限相同且长势一致的植株，采集花枝，将槐米粒从枝条上剥下后混合，分为杀青后烘干和直接烘干（60℃）2种干燥处理方法，其中杀青处理为：先将装有1/3水的不锈钢锅烧开，将槐米置于蒸笼上蒸15 min[17]。样品烘干后打粉过四号筛备用。样品信息见表1。

表1 金槐不同生长年限样品信息表（n=5）

2 方 法

2.1 色谱条件色谱柱：Diamonsil-C18(2)色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-1%乙酸水（B），梯度洗脱，洗脱程序为0～2 min，70%B；2～7 min，61%B；7～12 min，61%B；12～22 min，40%B；22～27 min，30%B；27～32 min，10%B；32～39 min，70%B；39～42 min，70%B；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；检测波长：257 nm；进样量：10 μL。色谱图见图1。

图1 5种黄酮类成分HPLC色谱图

2.2 对照品溶液的制备精密称取标准品芦丁57.940 0 mg、水仙苷17.360 0 mg、槲皮素21.200 0 mg、山奈酚11.350 0 mg、异鼠李素12.700 0 mg，分别用甲醇定容于10、10、10、250、250 mL容量瓶中，作为各标准品贮备液。分别精密量取芦丁、水仙苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素标准品贮备液8、5、2.5、1、5 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得芦丁、水仙苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素质量浓度分别为1 854、173.6、212、2.032、9.088 μg/mL的混合标准品溶液，待用。

2.3 供试品溶液的制备分别精密称定金槐样品粉末0.200 0 g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入95%甲醇50 mL，称定质量，35℃超声（功率：250 W，频率：25 kHz）30 min，放冷至室温，称定质量，用95%甲醇补足减失的质量，摇匀，取上清液过0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，待测。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下混合标准品贮备液0.25、0.5、1、2、3、4、5 mL至5 mL的量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得系列质量浓度的标准品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。以标准品质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，建立标准曲线。

2.4.2 精密度试验 精密称定供试品粉末（编号：2-N）0.2000 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录各成分峰面积并计算RSD值。

2.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液（编号：2-N），分别于0、2、4、8、12、24 h按“2.1”项下色谱条件进行检测，记录各成分峰面积并计算各成分含量RSD值。

2.4.4 重复性试验 精密称取同一批供试品粉末（编号：2-N）6份，按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行检测，记录各成分峰面积并计算RSD值。

2.4.5 加样回收率试验 分别精密称取已知含量的供试品粉末（编号：2-N）6份，每份0.100 0 g，精密加入已知含量100%的芦丁、水仙苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素的标准品溶液。按“2.3”项下方法制备供试溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样分析，分别计算加样回收率。

2.5 样品含量测定分别精密称取样品粉末0.200 0 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行分析，用外标法计算5种成分含量。

2.6 统计学方法应用Excel 2010记录数据，SPSS 20.0软件进行数据统计分析，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析，用SNK法进行显著性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 方法学考察结果芦丁、槲皮素、水仙苷、山奈酚和异鼠李素的回归方程及线性范围见表2。结果表明，5种黄酮类成分在各自范围内线性关系良好；精密度试验结果显示芦丁、槲皮素、水仙苷、山奈酚和异鼠李素峰面积的RSD值分别为0.12%、1.00%、1.17%、1.78%和1.87%，表明仪器精密度良好；稳定性试验结果显示芦丁、槲皮素、水仙苷、山奈酚和异鼠李素含量的RSD值分别为0.19%、0.19%、0.76%、1.78%和2.56%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好；重复性试验结果显示芦丁、槲皮素、水仙苷、山奈酚和异鼠李素峰面积的RSD值分别为0.33%、0.54%、1.35%、2.97%和2.78%，表明该方法重复性良好；加样回收率试验结果见表3。

表2 各成分的线性关系（n=6）

表3 各成分加样回收率试验结果（n=6）

续表3：

3.2 不同处理金槐芦丁含量比较J2和J3两个品种金槐的芦丁含量均随树龄的增长呈先升再降的趋势，均在树龄为6年时芦丁含量最高。在相同干燥方式下，J3的芦丁含量均高于J2，差异有统计学意义（P＜0.05）。杀青烘干处理后，J2和J3的芦丁含量均高于不杀青（直接烘干）处理，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中以6年生杀青后烘干的J3金槐芦丁含量最高，达38.41%；而不杀青处理的10年生J2的芦丁含量最低，为14.51%。杀青处理后金槐的芦丁含量均有所提高；相同干燥方式下，不同年限J3的芦丁含量均高于J2。（见图2）

图2 不同处理金槐芦丁含量（±s）

3.3 不同处理金槐水仙苷含量比较J3品种金槐的水仙苷含量随着树龄的增长呈先升再降的趋势，而J2品种金槐的水仙苷含量随树龄的增长呈现下降的整体趋势。在同一种干燥方式下，J3品种和J2品种的水仙苷含量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），6年生以上J3品种高于J2品种。杀青烘干处理后，J2和J3的水仙苷含量均高于不杀青（直接烘干）处理，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中6年生J3品种杀青后烘干的金槐水仙苷含量最高，达1.54%；而10年生J2品种不杀青处理的金槐水仙苷含量最低，为0.85%。杀青处理后水仙苷含量有所提高；相同干燥方式下，6年生以上J3品种的水仙苷含量高于J2品种。（见图3）

图3 不同处理金槐水仙苷含量（±s）

3.4 不同处理金槐槲皮素含量比较J3品种金槐不杀青（直接烘干）处理的槲皮素含量随着树龄的增长呈先升再降的趋势，而J2品种金槐的槲皮素含量随树龄的增长呈现下降趋势，但J2品种金槐经杀青后烘干的槲皮素含量随着树龄的增长变化趋势差异无统计学意义（P＞0.05）。在相同干燥方式下，J3品种和J2品种的槲皮素含量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），6年生以上J3品种高于J2品种。杀青后烘干的J2和J3芦丁含量均低于不杀青处理，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中6年生J3品种不杀青处理的槲皮素含量最高，达0.86%。结果表明，杀青处理使得金槐中的槲皮素含量降低；相同干燥方式下，6年生以上J3品种的槲皮素含量高于J2品种。（见图4）

图4 不同处理金槐槲皮素含量变化（±s）

3.5 不同处理金槐山奈酚含量比较金槐中的山奈酚含量不高，但J3品种金槐的山奈酚含量随着树龄的增长呈先升再降的趋势，而J2品种金槐的山奈酚含量随树龄的增长呈现下降趋势。在相同干燥方式下，J3品种和J2品种的山奈酚含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。杀青后烘干的J2和J3山奈酚含量均低于不杀青（直接烘干）处理，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明杀青处理使得金槐中的山奈酚含量降低；相同干燥方式下，两个品种山奈酚含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图5）

图5 不同处理金槐山奈酚含量变化（±s）

3.6 不同处理金槐异鼠李素含量比较J3品种金槐不杀青（直接烘干）处理的异鼠李素含量随着树龄的增长呈先升再降的趋势，而J2品种金槐的异鼠李素含量随树龄的增长呈现下降趋势，但两个品种金槐经杀青后烘干的异鼠李含量随着树龄的增长变化差异无统计学意义（P＞0.05）。在相同干燥方式下，J3品种和J2品种的异鼠李素含量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），6年生以上J3品种高于J2品种。杀青后烘干的J2和J3芦丁含量均低于不杀青处理，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中6年生J3品种不杀青处理的槲皮素含量最高，达0.07%。结果表明杀青处理使得金槐中的异鼠李素含量降低；相同干燥方式下，6年生以上J3品种的异鼠李素含量高于J2品种。（见图6）

图6 不同处理金槐异鼠李素含量变化（±s）

4 讨 论

4.1 金槐5种黄酮类成分测定方法优化近年来，有关金槐的研究报道多集中于栽培技术[18]、营养成分[19]和生理特性[20-21]等方面，多以芦丁和槲皮素[22-24]作为金槐的内在成分评价指标。本研究在前期采用标准品指认金槐样品中黄酮类成分除含有芦丁外，还含有水仙苷、槲皮素、异鼠李素和山奈酚成分，于是建立了HPLC法同时测定金槐中芦丁、水仙苷、槲皮素、异鼠李素和山奈酚含量的方法。（1）提取方法优化：本研究以5种黄酮类成分的含量为考察指标，比较了不同提取溶剂（乙腈、甲醇和乙醇）的提取效果。结果显示甲醇溶剂提取液色谱基线平稳，出峰分离度更好。进一步考察甲醇溶液体积分数（50%、65%、80%、95%）和溶剂用量（20、30、40、50 mL）的提取效果，结果显示以50 mL的95%甲醇溶液提取，各成分的提取率最高。考察超声时间（20、30、40、50 min）和超声温度（25、35、45、55℃）对提取效率的影响，结果显示提取时间过长和温度过高会降低提取率，在超声温度为35℃和超声时间为30 min时，5种黄酮类成分的得率最高。（2）色谱条件优化：本研究比较了Spursil C18-EP色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）、Diamonsil-C18(2)色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和XBridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），结果显示在检测时间范围内，使用Spursil C18-EP（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱时，各化合物极性较大，均未出峰；使用XBridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱时，只检测到芦丁成分；使用Diamonsil-C18(2)色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）时，5种黄酮类成分色谱峰的保留时间较为合适且峰形较好。进一步考察流动相体系（乙腈-1%冰乙酸和甲醇-1%冰乙酸）、柱温（30、35℃）和流速（1.0、1.2 mL/min）对测定结果的影响，综合考虑峰面积、拖尾因子和分离度等因素，选择甲醇-1%冰乙酸溶液为流动相，在35℃柱温条件下，以1.0 mL/min进行梯度洗脱效果较好。

4.2 不同生长年限及品种对金槐黄酮类成分的影响金槐是花类药材，开花标志着植物由营养生长向生殖生长转变，这个过程影响着植物次生代谢产物的合成积累[25]。有研究比较了不同生长年限野生金槐（20年以下、20～30年、30年以上）与栽培金槐的芦丁含量，发现栽培金槐可作为野生金槐的替代品[17]。本研究的J2和J3均为栽培金槐品种，幼龄期短，较实生树成花早。本研究比较了金槐J2和J3两个品种不同生长年限金槐的5种黄酮类成分，相同干燥方式下各成分整体上以10年生的含量较低，其中6年生的J3金槐中山奈酚和水仙苷的含量明显高于3年生和10年生（P＜0.05），且J2和J3金槐样品中山奈酚和异鼠李素含量均较低，两者含量同样随着生长年限的增长呈现波动变化。覃芳等[21]对J1、J2和J3金槐品种的生理特性进行了比较研究，但未考察3个品种的内在成分含量差异。本研究结果发现相同干燥方式下6、10年生的J3品种金槐的芦丁、水仙苷、槲皮素和异鼠李素含量均高于相同生长年限的J2品种。在金槐品种推广时，J3品种的药效成分含量可作为推广优势，但作为一种特色中药材，产量也是推广中考虑的重要因素之一。由于本试验只进行了特征性成分含量的对比，下一步的研究中可结合产量进行综合评价。另外，种质的遗传基因也影响着次生代谢产物的合成与积累，金槐不同品种间特征性成分含量不一的内在原因也有待从遗传基因和生理代谢角度进一步研究。

4.3 不同加工方式对金槐黄酮类成分的影响杀青会使金槐的药效成分发生变化。本研究发现，J2和J3品种经杀青处理后，其芦丁和水仙苷含量均明显提高，而槲皮素、山奈酚和异鼠李素含量有所降低。芦丁由槲皮素的C-3位上连接了鼠李糖和葡萄糖苷而成，山奈酚和异鼠李素均为槲皮素异构化的衍生物。有研究[26]认为未经杀青的槐米中的芦丁和水仙苷在水解酶的作用下可分解为槲皮素和异鼠李素，这可能是杀青后烘干（水开后蒸至15 min后，60℃烘干至恒重）金槐中的芦丁和水仙苷含量高于直接干燥，而槲皮素和异鼠李素含量低于直接干燥的原因。该研究直接烘干的金槐芦丁含量在14.51%～29.96%之间，而杀青后烘干的含量在23.28%～38.41%之间，均高于《中华人民共和国药典》标准（15.0%）[1]；无论何种处理，槲皮素、山奈酚和异鼠李素含量均低于1%，杀青导致的这3种成分含量降低的程度也不高。5种黄酮类成分中芦丁含量最高，在干燥之前的杀青处理对槲皮素、山奈酚和异鼠李素的变化影响较小，而对芦丁和水仙苷的含量变化影响较大。芦丁具有抗氧化、抗自由基活性、抗炎、降血糖、降血压、免疫调节等作用，水仙苷具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等多种生物活性，这与现代药理研究报道的槐米具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌及抗病毒等作用一致[8,27]。所以金槐的干燥加工中，须注意在干燥前进行杀青处理。

5 结 论

本研究建立HPLC法同时测定金槐不同处理下5种黄酮类成分的含量变化，验证了本方法准确、稳定性和重复性好。相同干燥方式下6、10年生的J3品种金槐的芦丁、水仙苷、槲皮素和异鼠李素含量均高于相同生长年限的J2品种；杀青后烘干金槐中芦丁和水仙苷的含量明显高于直接烘干；J3品种经杀青烘干处理其芦丁和水仙苷含量随着生长年限的增加，呈现先升后降的趋势，以6年生含量最高。金槐的采收要注意蒸汽杀青的适时应用；金槐品种推广可注意J3品种的推广力度，但因本研究未对两个品种的产量进行比较，不能仅以特征性成分含量高低判定J3品种好坏；另外，在金槐的种植中，需注意老龄树种的维护工作以保证其质量。本研究可为金槐的质量检测提供方法参考，同时可为金槐的干燥加工方式提供理论依据。