基于正交设计结合G1-熵权法优选温经膏的制备工艺研究

陶叶琴，牛江进，谢宗明，袁 淼，熊 丹，蒋翠平

（浏阳市中医医院，湖南 浏阳 410300）

温经汤出自张仲景《金匮要略·妇人杂病脉证并治第二十二》，临床上多采用其加减方治疗原发性痛经[1-3]。温经汤是妇科调经之要方，临床应用广泛，具有很好的开发价值。“温经膏”处方是以温经汤为基础方加减而来，由当归、川芎、牡丹皮、吴茱萸、阿胶等药材组成，具有温经散寒、养血祛瘀、补益天癸、调畅气血的攻效，用于女性冲任虚寒兼有瘀滞者。该品种已在我院广泛使用多年。为了能更好地服务临床，此次开发煎膏剂，并采用单剂量包装，这样不仅保留了原方的特点和优势，而且方便了患者的用药以及确保服用剂量的准确、可控。合理的工艺设计是保障中药质量的关键。如何最大限度地提取和保留温经膏临床起效物质是本试验提取工艺的关键因素。

温经汤药味较多，成分复杂多样，为确保制剂工艺的精制有效，选取多个指标成分同时优化工艺参数，而多指标的权重赋予是综合评分科学合理的直接体现，是优选提取工艺和保证中药质量和疗效的关键。G1-熵权法是一种主观赋权法和客观赋权法相结合的方法，既可避免人为赋权过于主观，又可避免试验数据出现误差后所导致综合评价结果出现的较大偏差[4-7]。正交设计与G1-熵权组合赋权法相结合，能提高所得试验结果的科学性与严谨性，使优选出的工艺更具合理性及可行性[8]。因此，本试验将正交设计与G1-熵权组合赋权法相结合对温经膏的提取工艺进行优化，并对其浓缩工艺和成型工艺进行研究，为该制剂的工业化生产及质量标准研究奠定基础。

1 材 料

1.1 仪器LC-10AT型高效液相色谱仪（日本岛津仪器有限公司）；L5S型紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；BS224S-CW型电子天平（德国赛多利斯）；CH-0.1AM型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；GENIUS4K型低速离心机（长沙鑫奥仪器仪表有限公司）；DHG-9240A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试药当归、川芎、牡丹皮、吴茱萸、阿胶等19味药材，其中阿胶来源于湖南东健药业有限公司，其他18味药材均购自湖南省金实堂中药饮片有限公司，经浏阳市中医医院谢宗明主任中药师鉴定为正品，符合2020年版《中华人民共和国药典》一部有关规定。丹皮酚（批号：110796-201136，纯度：99.8%）、阿魏酸（批号：110773-201915，纯度：99.7%）、蔗糖均购自湖南九典宏阳制药有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，购自德国默克股份有限公司；其他试剂为分析纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 阿魏酸、丹皮酚含量测定

2.1.1 色谱条件[9-12]采用InertsilODS-3C柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相（阿魏酸含量测定）：0.05%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min，88%A→85%A，10～20 min，85%A→84%A，20～60 min，84%A→35%A，60～65 min，35%A→88%A，65～70 min，88%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：320 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。流动相（丹皮酚含量测定）：0.05%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～25 min，95%A→78%A，25～35 min，78%A→70%A，35～45 min，70%A→40%A，45～60 min，40%A→20%A，60～66 min，20%A→95%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：274 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL；分离度＞1.5。色谱图见图1～2。

图1 阿魏酸对照品（A）、供试品（B）、缺当归、川芎的阴性对照（C）HPLC图

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸10.20 mg，置25 mL棕色容量瓶中，用70%色谱甲醇溶解定容至25 mL，即得阿魏酸对照品溶液；精密称取经P2O5干燥器干燥24 h的丹皮酚对照品10.14mg置于25mL容量瓶中，用50%色谱甲醇定容至25mL，即得丹皮酚对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 分别吸取正交试验项目下9组供试样品各5 mL，置于10 mL离心管中，4 000 r/min离心10 min，吸取上层清液过0.22 μm的微孔滤膜，得供试品溶液。取续滤液，即得。

2.1.4 阴性对照溶液的制备 分别按温经膏处方的配比精密称定除当归和川芎、牡丹皮的处方，按温经膏的提取方法和“2.1.3”项下供试品溶液的处理方法，分别制得缺当归和缺川芎的阴性对照溶液、缺牡丹皮的阴性对照溶液。

图2 丹皮酚对照品（A）、供试品（B）、缺牡丹皮的阴性对照（C）HPLC图

2.1.5 线性关系考察 分别精密吸取上述对照品溶液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL置于10 mL容量瓶中，丹皮酚对照品溶液用50%甲醇稀释至相应浓度；阿魏酸对照品溶液用70%甲醇稀释至相应浓度，摇匀，按“2.1.1”项下条件进样测定，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），计算回归方程为：阿魏酸Y=126 633X+48 302，r=0.999 8；丹皮酚Y=10639X+6 785.7，r=0.999 9，结果表明阿魏酸、丹皮酚分别在10.68～213.6、10.14～243.36 μg/mL的范围内线性关系良好。

2.1.6 精密度试验 分别取阿魏酸、丹皮酚对照品溶液按“2.1.1”项下色谱条件重复进样6次，阿魏酸、丹皮酚峰面积RSD值分别为0.92%、0.67%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 取温经膏水提供试品溶液分别于制备后0、3、6、9、12、24 h，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，阿魏酸、丹皮酚峰面积RSD值分别为0.74%、0.83%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.8 重复性试验 平行制备6份温经膏水提供试品溶液，分别按“2.1.1”项下色谱条件进样，阿魏酸、丹皮酚峰面积RSD值分别为1.97%、1.34%，结果表明方法重复性良好。

2.1.9 加样回收率试验 取含量已知的供试品水提溶液6份，每份1 mL，分别精密加入对照品溶液1 mL，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析。结果显示，阿魏酸、丹皮酚平均加样回收率分别为97.83%、99.67%，RSD值分别为1.71%、0.56%。表明方法准确性良好。（见表1）

表1 加样回收率试验结果

2.1.10 样品测定 取待测供试品溶液按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录阿魏酸和丹皮酚的色谱峰面积，分别代入“2.1.5”项下的回归方程计算各成分在供试品中的质量浓度，并以对应药材量计算阿魏酸和丹皮酚在供试品中的含量。

2.2 干膏率的测定精密吸取已定容的提取液25 mL，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃条件下干燥3 h，置于干燥器中冷却0.5 h，迅速精密称定，至两次质量差异不超过0.3mg，记录各样品液的干膏质量，按以下公式计算干浸膏得率。

注：W.干浸膏质量（g）；W1.药材取样量（g）；V.定容体积（mL）

2.3 评价指标的组合赋权

2.3.1 G1法主观赋权[13-14]建立评价指标y1，y2，…ym，确定各评价指标的序关系，记为y1＞y2＞…ym（相对于某评价目标的序关系）。根据实际情况及参考文献得出相邻2个准则层yk-1与y重要性程度之比rk的理性赋值。确定了rk的理性赋值后，权重系数wk的计算，见公式（1）。

2.3.2 熵权法客观赋权[15-16]熵权法是一种根据各项指标观测值来确定指标权重的方法。熵用来度量系统混乱程度或无序程度，如果指标的熵值越小，则它所包含的信息越多，在综合评分中所占的比重越大，操作如下：

第一步：原始数据矩阵归一化。归一化后得到属性矩阵R=（rij）n×m（m表示评价指标个数、n表示评价对象个数），进行归一化，见公式（2）。

yij表示第i个评价对象的第j项指标数值；yjmax、yjmin分别是yij的最大和最小值；i为1，2，…，n；j为1，2，…，m。

第二步：求指标熵值。

第三步：计算指标权重系数。

2.3.3 组合权重的确定[9]用w1、w2分别表示G1法得到的主观权重，熵权法得到的客观权重，组合权重计算公式为（5）。

2.4 提取工艺研究

2.4.1 浸泡时间考察[17-18]浸泡时间的长短是影响提取效果的因素之一，中药饮片煎煮前适宜的浸泡能够让药材吸水至饱和状态，有利于有效成分的溶出，但浸泡时间过长则易导致药材霉败，化学成分酶解等不良影响。现将吸水率作为考察指标,通过单因素试验对浸泡时间进行考察。

（1）试验方法：按处方配比称取药材（182 g）9份，置于3 000 mL烧杯中，各加10倍量水没过药材，密闭，室温放置。分别浸泡10、15、20、30、40、50、60、70、80 min后，纱布过滤，测量滤液体积，按下式计算各时间点药材的吸水率。

（2）试验结果：药材在30 min以后的吸水率无明显变化，说明药材此时吸水已经达到饱和，从生产实际出发，既要充分浸泡，又要节省时间，因此最终确定药材浸泡时间为30 min。（见表2）

表2 浸泡时间考察试验结果

2.4.2 正交试验设计 按处方配比称取组方182 g，共9份，以加水倍量、提取时间、提取次数为考察因素，以阿魏酸、丹皮酚提取量及浸膏得率为评价指标，采用L9（34）正交设计优选温经膏的水提工艺参数，因素水平见表3。

表3 因素水平表

根据处方的君、臣、佐、使配伍原则，用G1法来确定3个评价指标的重要关系为阿魏酸提取量＞丹皮酚提取量＞浸膏得率，并确定各指标的权重评价标度，其中r2=1.2，r3=1.4。根据r2、r3得到各指标的主观权重值w1。根据提取工艺的试验结果，选取熵权法计算各指标的客观权重值w2。最后根据公式（5）来计算组合权重值（W），并计算9组试验的指标综合评分Pj，并进行统计学分析。组合权重结果见表4。

表4 评价指标权重值

直观分析结果如表5，方差分析结果见表6，Pj计算公式为公式（6）。

表5 试验设计及结果

表6 方差分析

结果表明，各因素对试验结果综合评分的作用主次为B＞C＞A，其中B3＞B2＞B1，C2＞C3＞C1，A2＞A3＞A1；由方差分析可知，在α=0.05时，因素B（提取时间）对试验结果的综合评分有显著性影响，其他两个因素均无显著性影响。综合生产实际和保证临床疗效，最终选取A2B3C2为最佳提取工艺，即共提取2次，第一次加10倍量的水，提取2h，第二次加8倍量的水，提取1.5h。

2.4.3 验证试验 根据优选的提取工艺A2B3C2，进行了3次验证试验，其综合评分分别为97.91、99.90、98.57；x=98.79，RSD=0.84%，3批数据无显著性差异，结果表明优选的水提工艺参数稳定、合理可行。

2.5 浓缩工艺考察

2.5.1 浓缩方式考察 称取6个处方量的药材，按上述已经优选的提取工艺进行提取，提取液分成等量的6份，其中3份采用常压浓缩；另外3份采用减压浓缩（温度70℃，真空度-0.06～-0.08 Mpa）。在浓缩至相对密度约为1.25（60℃）时取样检测，结果见表7。综合评分=丹皮酚含量/丹皮酚含量最大值×1/3×100+阿魏酸含量/阿魏酸含量最大值×2/3×100。

表7 浓缩工艺中浓缩方式考察结果（n=3）

试验结果表明，浓缩方法对阿魏酸和丹皮酚含量影响均较大，其中减压浓缩优于常压浓缩，所以参考综合评分的结果，最终采用减压浓缩（温度为70℃，真空度-0.06～-0.08 Mpa）作为温经膏的浓缩方法。

2.5.2 浓缩温度考察 按处方配比称取12份样品，按优选的最佳提取工艺，参考实际生产情况，分别考察60℃、70℃、80℃、90℃减压浓缩温度对温经膏中指标性成分阿魏酸和丹皮酚的含量影响情况。结果表明，阿魏酸在70℃减压浓缩时，含量最高；丹皮酚在60℃减压浓缩时，含量最高。根据综合评分，阿魏酸、丹皮酚的综合评分在70℃含量最高。结果表明70℃是最优减压浓缩温度。（见表8）

表8 浓缩工艺中浓缩温度考察结果（n=3）

2.6 成型工艺研究取制备好的浸膏30 g共5份，按表8加入不同配比的炼糖，不断搅拌，继续加热，再按处方配比加入烊化后的阿胶，混匀，收膏。分别取一定量品尝，观察状态并按2020年版《中华人民共和国药典》项下方法检测不溶物和相对密度。结果见表9。

表9 炼糖用量考察试验结果表

结果表明，当m（炼糖）∶m（清膏）=1.5∶1和2∶1时，口感改善均较明显，考虑到尽可能减少辅料用量，降低服用量，又利于成型，最终选择m（炼糖）∶m（清膏）=1.5∶1。此时成品的口感较好，黏稠度适中，不溶物符合规定，相对密度为1.342（60℃），根据前期经验，该密度既能满足煎膏剂要求，其流动性又能满足包装设备要求。另外，根据2020年版《中华人民共和国药典》四部规定，煎膏剂加炼糖的量，要求不超过清膏量的3倍，本工艺加入炼糖的量仅为清膏量的1.5倍，符合药典要求。

2.7 含量测定色谱条件同“2.1.1”项，溶液制备同“2.1.2”“2.1.3”“2.1.4”项，线性关系考察同“2.1.5”项方法，精密度试验“2.1.6”项方法，稳定性试验同“2.1.7”项方法，重复性试验同“2.1.8”项方法，加样回收率试验同“2.1.9”项方法。取3批温经膏，进行含量测定，结果见表10。3批成品中阿魏酸、丹皮酚的含量比较稳定，说明该工艺稳定性好，检测方法可行。

表10 含量测定结果

3 讨 论

本试验从提取、浓缩和成型3个方面对温经膏的工艺进行了较为全面的研究。温经膏组方药味较多，成分复杂，单一浸膏得率并不能完全反映温经膏的内在质量。温经汤中吴茱萸辛散温通，温经散寒；当归、川芎活血祛瘀，养血调经；牡丹皮既助活血散瘀，又清血分虚热；诸药配伍，共奏温经散寒、养血祛瘀之效。上述中药在“温经膏”中针对主病主证起主要治疗之作用，为本膏方之君药部分。吴茱萸因有小毒，在整个处方中的药占比偏低，从而使吴茱萸的主要有效成分吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量偏低，不易检测；阿魏酸是2020年版《中华人民共和国药典》一部中当归和川芎质量控制的指标成分；丹皮酚是牡丹皮中主要的有效成分，且为牡丹皮质量控制的指标成分。因丹皮酚可随水蒸气蒸馏，阿魏酸不稳定，见光、加热均易分解，在水提和浓缩过程中，提取次数、提取时间、浓缩方法和浓缩温度都会对阿魏酸和丹皮酚的含量产生影响[19-21]，故选择将阿魏酸和丹皮酚的含量测定作为温经膏水提工艺和浓缩工艺的重要考察指标。

本研究将熵权法和G1法有效地结合起来，从主观、客观两方面进行综合评价，可同时兼顾决策者的主观性和待评价对象各指标的内在联系。这将使温经膏提取工艺的多指标综合评价结果更加科学合理。本研究通过单因素考察，确定了温经膏水提的最佳浸泡时间。本研究采用基于G1-熵权法的主客观组合赋权法的L9（34）正交设计，以加水量、提取时间和提取次数为考察因素，丹皮酚、阿魏酸提取量及干膏率为评价指标，优选出温经膏的最佳水提工艺，最佳水提工艺为第1次加10倍量水，浸泡0.5 h，煎煮2.0 h，第2次加8倍量的水，煎煮1.5 h。本研究从浓缩方式和浓缩温度两方面分别对浓缩工艺进行研究，结果表明，当温度为70℃，真空度为-0.06～-0.08 Mpa时，浓缩过程对阿魏酸和丹皮酚的破坏最小。成型工艺方面主要是从炼糖与清膏的配比进行考察，当炼糖与清膏质量比为1.5∶1时，成品的口感较好，黏稠度适中，不溶物符合规定，相对密度既能满足煎膏剂要求，其流动性又能满足包装设备要求。最后经3批试验验证，重复性良好。

本研究筛选出的温经膏制备工艺稳定可行，建立的含量测定方法专属性强、准确度高、重现性好，能够作为温经膏的质量控制标准。由于实验条件限制，本研究未能建立温经膏多组分一测多评的含量测定方法，这是本试验的不足之处。课题组后续将对温经膏进行高效液相指纹图谱研究，在此基础上采用HPLC多波长切换法实现温经膏多种成分含量测定，旨在为温经膏的关键质量属性研究提供参考，为后续相关制剂的制备工艺、质量控制以及产品安全性、稳定性的评价提供借鉴。