云南白族民间药小叶石梓的抗肿瘤活性研究*

倪 亮，吴 琼，王文渊，刘继平，旷 翔，姚 毅，张先林

（1.南京中医药大学附属医院/国家级中药炮制技术传承基地，江苏 南京 210029；2.贵州同德药业有限公司/铜仁市中药饮片炮制工程技术研究中心，贵州 铜仁 554300；3.贵州信邦中药材发展有限公司，贵州 铜仁 554300）

小叶石梓（Gmelina delavayana P.Dop）为马鞭草科（Verbenaceae）石梓属（Gmelina）植物，主要分布于云南漾濞及金沙江支流河谷（邓川、鹤庆、宾川、永胜等），海拔1 500～1 700 m的石灰岩丛林下或灌丛中，或干燥荒坡上。（见图1）该属植物全球约有35种，我国分布有7种[1]。

图1 小叶石梓形态特征

马鞭草科石梓属植物如云南石梓、小叶石梓、石梓，其根、叶、花、果实、干皮等作为哈尼族、傣族、黎族、彝族等多个少数民族的民间用药，被广泛用于多种疾病的治疗[2-4]。该属植物云南石梓（Gmelina arborea Roxb.）是一种珍贵的药用乔本树种，在印度传统医学体系中有驱虫、抗菌、抗糖尿病、利尿、肝保护、抗癫痫等功效[5]。现代研究[6-8]发现该属植物还具有抗肿瘤、神经保护、抗炎等生物活性。《西昌中草药》记载小叶石梓的根具有健胃消食、理气镇痛、化痞截疟的作用[9]。石梓属植物中主要含有环烯醚萜苷、木脂素、芳基酰化的鼠李糖苷、黄酮、生物碱等化学成分[10]。目前石梓属的化学与药理研究主要集中于乔木云南石梓的开发利用[5]，而对于云南特有的小灌木小叶石梓的化学成分与药理活性研究尚未有报道。本研究将小叶石梓根的乙醇提取液利用不同极性的溶剂进行萃取，通过MTT法检测这些极性部位对人乳腺癌细胞（MCF7）、人小细胞肺癌细胞（NCI-H446）及人宫颈癌细胞（Hela229）增殖的影响，以期为小叶石梓的综合开发利用提供理论依据。

1 材 料

1.1 药材小叶石梓根于2019年5月采挖于云南省大理市洱源县，经江苏省中医院姚毅主任中药师鉴定为马鞭草科（Verbenaceae）石梓属（Gmelina）植物小叶石梓（Gmelina delavayana P.Dop）的干燥根。标本经烘干、粉碎、过60目筛后，存放于贵州同德药业有限公司铜仁市中药饮片炮制工程技术研究中心，置于4℃冰箱保存。

1.2 试剂特级胎牛血清（批号：Sa211109）、DMEM高糖（含双抗）（批号：202006）、RPMI-1640（含双抗）（批号：202006）、MCF7细胞专用培养基（批号：202007）均购自普诺赛公司；CCK-8法细胞增殖检测试剂盒（批号：YFXCA01）购自翼飞雪公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）（批号：112520210402）购自Solarbio公司；乙腈为色谱纯，购自德国默克公司；其他化学试剂均为分析纯，购自上海国药化学试剂公司。

1.3 细胞人宫颈癌细胞（Hela229）、人小细胞肺癌细胞（NCI-H446）、人乳腺癌细胞（MCF7）均购自普诺赛公司。

1.4 主要仪器BT125型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；Milli-Q Advantage超纯水系统（美国Millipore公司）；Waters ACQUITY UPLC系统（包括四元泵溶剂系统、在线脱气机和自动进样器）（美国Waters公司）；AB Sciex TripleTOF 5600三重四级杆质谱仪、Waters MsaaLynx V 4.1工作站、EnSpire型多功能酶标仪（美国帕金埃尔默PerkinElmer公司）；微孔板恒温振荡器（杭州米欧仪器有限公司）；1300 series A2超净工作台（美国Thermo公司）；Forma seriesⅡwater jacket型CO2培养箱（美国Thermo公司）。

2 方 法

2.1 小叶石梓浸膏及各极性部位的制备取小叶石梓的根粉碎并在105℃条件下烘干，用60%的乙醇按1∶10的比例加热回流提取2 h，连续提取3次，合并提取液。减压回流浓缩成浸膏，干燥，称质量。将浸膏用水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正定醇萃取，获得小叶石梓的不同极性部位。取小叶石梓的不同极性部位冷冻干燥成粉末，精密称量，分别加入二甲亚砜制成质量浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的小叶石梓醇提物不同极性部位溶液，4℃冰箱保藏待用。

2.2 MTT法测定各部位抗肿瘤活性

2.2.1 肿瘤细胞的培养 采用10% FBS（含DMEM、特级胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素）培养基、MCF7细胞专用培养基，在37℃、5%CO2、相对湿度为90%的细胞培养箱中分别培养Hela229、NCI-H446、MCF7。每隔1 d更换1次培养基，每3 d传代1次。

2.2.2 小叶石梓提取物不同极性部位对3种肿瘤细胞活力的影响 取对数生长期的3种肿瘤细胞，调整细胞密度至2×103个细胞/孔，均匀接种于96孔板中，于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h；弃去培养基，分别加入200 μL质量浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的小叶石梓醇提物不同极性部位，平行3个复孔，于37℃、5% CO2培养箱中培养细胞24 h；弃去培养基，加入90 μL 1% FBS培养基和10 μL MTT（5 mg/mL）溶液，共同孵育细胞3 h；再次弃去培养基，96孔板各孔中加入150 μL二甲基亚砜，37℃恒温振荡器振荡30 min。酶标仪570 nm下测量各孔的吸光度，并计算细胞IC50。

2.3 小叶石梓乙酸乙酯部位化学成分分析UPLC色谱条件：采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以0.1%甲酸溶液（A）和乙腈（B）为流动相，梯度洗脱：0～12 min，5% B～50% B；12～13 min，50% B～100% B；13～14min，100% B～5% B；14～15min，5%B～5% B。流速为0.4mL/min；柱温为30℃；检测波长为535 nm；进样体积为2 μL。

质谱条件：AB Sciex TripleTOF 5600三重四级杆质谱仪，电喷雾离子源（ESI）对样品进行离子化（ESI+/ESI-），质量扫描范围（m/z）：100～1 000，毛细管电压为3.0 kV，锥孔电压为45 V；离子源温度为120℃，脱溶剂气温度为350℃；锥孔气流量为50 L/h，脱溶剂流量为600 L/h。在碰撞能量为4 eV情况下，扫描时间为0.5 s，间隔扫描时间为0.02 s。采用亮氨酸·脑啡肽溶液作为标定溶液（1eucine-enkephalin，ESI+（m/z）：556.277 1，ESI-（m/z）：555.261 5，质量浓度为200 pg/mL，流速为100 μL/min；采用Waters MsaaLynx V 4.1工作台进行数据采集。

3 结果与分析

3.1 小叶石梓不同极性部位及得率按“2.1”项下方法测定小叶石梓不同极性部位萃取得率，浸膏得率为9.58%；石油醚部位得率为0.16%；乙酸乙酯部位得率为1.92%；正丁醇部位得率为2.81%；萃余水部位得率为3.84%。（见图2）

图2 小叶石梓各极性部位及得率

3.2 小叶石梓各萃取部位抗肿瘤活性按“2.2”项下方法测定小叶石梓各极性部位抗肿瘤活性，结果乙酸乙酯极性部位对MCF-7、NCIH446、Hela229增殖具有良好的抑制作用，IC50分别为（39.79±0.87）、（43.29±0.62）、（41.82±0.37）μg/mL。（见表1）

表1 小叶石梓各部位抗肿瘤活性IC50值（±s，μg/mL）

表1 小叶石梓各部位抗肿瘤活性IC50值（±s，μg/mL）

部位 MCF-7 NCI-H446 Hela229总提取物 85.52±0.92 126.18±0.36 141.78±0.52石油醚部位 127.81±0.76 157.73±0.29 132.60±0.57乙酸乙酯部位 39.79±0.87 43.29±0.62 41.82±0.37正丁醇部位 69.49±0.43 72.12±0.22 69.49±0.21萃余水部位 210.83±1.62 263.99±0.51 191.56±0.97

3.3 小叶石梓乙酸乙酯部位化学成分鉴定按“2.3”项下方法对小叶石梓乙酸乙酯部位化学成分进行鉴定，通过Q-TOFMS-MS鉴定出该部位的11个主要化合物。（见图3）

图3 小叶石梓乙酸乙酯萃取部位色谱图

根据质谱总离子流图中的碎片离子峰得到碎片离子信息，结合文献[3]鉴定其为芳基酰化的鼠李糖苷类化合物，其可能的化学结构式见表2、图4。

图4 1～11号峰的化学结构

表2 LC-MS/MS鉴定化合物1～11

4 讨 论

石梓属植物作为民族药在国内外受到广泛的关注研究，前期文献研究发现云南石梓具有良好的抗肿瘤活性。云南石梓的地上部分氯仿提取物对于MCF7具有明显的细胞毒性[11]。SRINIVASA C等[12]利用云南石梓果实提取物在水介质中合成氧化锰纳米粒子，其在400 μg/mL浓度下对MCF-7乳腺癌细胞的抑癌率高达96%。ANGAMUTHU T等[13]发现云南石梓乙醇提取物对结肠癌细胞株（COLO 201）、胃癌细胞株（HT 29）、人食管癌细胞株（TE-2）具有较强的细胞毒性。云南石梓的根部水提物对于阿霉素化疗引起的肾毒性有剂量依赖性保护作用，这可能与其多酚和黄酮类化合物的抗氧化能力有关[14]。另外，有研究者[15-16]利用云南石梓木部残渣制备银纳米粒子，通过自由基清除实验，确定其具有增强的抗菌、抗菌膜、抗氧化和伤口愈合特性。另外，石梓属的植物还有抗腹泻、促进创面愈合、抗糖尿病、抗炎和治疗失忆等功效[17-20]。本研究发现其同科同属植物小叶石梓根乙酸乙酯部位对于人乳腺癌细胞（MCF7）、人小细胞肺癌细胞（NCI-H446）及人宫颈癌细胞（Hela229）具有一定的细胞毒性。乙酸乙酯部位主要成分鉴定为芳基酰化的鼠李糖苷类化合物，确定小叶石梓根中的芳基酰化的鼠李糖苷类化合物为其抗肿瘤的有效成分。结合二级质谱离子碎片及相关参考文献可推测出乙酸乙酯部位1～11号峰的可能结构，由于无法通过质谱准确鉴定同分异构体的取代情况，故只能推测其可能结构为芳基酰化的鼠李糖苷类化合物，后期可继续对其化学成分进行深入的分离鉴定，通过核磁等技术进一步确定其准确结构。小叶石梓为云南省大理市白族使用的民间药物，其白族语名称为“席刮呆”。小叶石梓根在当地被用于治疗妇科肿瘤，并且已经流传多年，具有较好的抗肿瘤疗效。小叶石梓作为中国特有的石梓属小灌木，目前其药理作用与化学成分研究较少。我们也将继续在这个方面开展研究工作，以期为民族药小叶石梓的综合开发利用提供理论和实践依据。