银翘散UPLC指纹图谱研究*

刘满超，刘玉梅，张家俊，胡美忠，郁建生

(1.铜仁职业技术学院国家民委中兽药重点开放实验室，贵州 铜仁 554300；2.贵州健康职业学院健康管理系，贵州 铜仁 554300)

银翘散出自清代名医吴塘的《温病条辨》，主要功效为辛凉透表、清热解毒，主要用于外感风寒、发热头痛、口干咳嗽、咽喉疼痛、小便短赤等病症[1]。基于绿色养殖的理念，加上养殖界的禁抗运动，近年来有不少动物养殖机构将银翘散用于预防和治疗养殖动物的高热[2]、禽流感[3-4]、大肠杆菌感染[5-6]、保胎[7]等，且效果良好。其配方中有金银花、连翘、桔梗、薄荷、淡豆豉、淡竹叶、牛蒡子、荆芥、芦根和甘草共10味中药材[1]。《中华人民共和国药典》中银翘散的含量测定项下只对牛蒡苷的含量进行了规定，但银翘散中有10味中草药，且每种药材中的化学成分都非常复杂，这就使得对银翘散的质量控制(如果只测定牛蒡苷)是不够的。中药指纹图谱技术基于其能从整体上把控中药的质量，该技术在中药质量控制中的地位日渐上升[8-9]。本研究主要应用UPLC技术对不同厂家的27批次银翘散进行指纹图谱分析，建立了该条件下银翘散的标准指纹图谱，并对所得谱图数据进行相似度分析，主成分分析和聚类分析，为更为合理的评价银翘散的质量提供了一定的实验支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Agilent 1290 UPLC 分析仪 ( 检测器为 DAD，配置自动进样器，Agilent LC 色谱工作站)，流动相所用乙腈为色谱纯，产自德国默克公司；超纯水；其余试剂均为分析纯。27批次银翘散均采购自自由市场，编号从S1到S9，产自厂家1；编号S10-S18产自厂家2；编号S19-S27产自厂家3。

1.2 UPLC采集条件

Agilent ZORBAX SB-C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm) 色谱柱，检测波长 230 nm，柱温 30 ℃，进样量为 1 μL，以0.02% 磷酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～3 min，80% A; 3～3.1 min，80%～70% A; 3.1～6 min，70% A; 6～6.1 min，70%～60% A; 6.1～9 min，60% A；9～9.1 min，60%～50% A; 9.1～12 min，50% A; 12～12.1 min，50%～40% A; 12.1～15 min，40% A；15～15.1 min，40%～30% A; 15.1～18 min，30% A；18～18.1 min，30%～20% A; 18.1～21 min，20% A；21～21.1 min，20%～10% A; 21.1～24 min，10% A。流速 0. 3 mL/min)。

1.3 供试品溶液的制备

取银翘散 5 g，研钵研细，过100目筛，精密称取 0.2000 g，置 10 mL 离心管中。精密加入50% 甲醇水 10.00 mL，称定质量。超声提取 30 min (功率 300 W，温度 50 ℃)，再称定质量。用50% 甲醇水补足失重，摇匀，静置 10 min，微孔滤膜(0. 22 μm)过滤至UPLC进样瓶中，置 4 ℃ 冰箱中待测定。

1.4 UPLC谱图采集

按照“1.3”项下方法制备所有的供试品溶液，按照“1.2”项下所列方法，对所有样品进行UPLC色谱图采集。

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度试验

取同一批次银翘散1份，按照“1.3”项下所描述的方法制备供试品试液，然后按照“1.2”项下描述的方法进行UPLC色谱图采集，连续进样6次。考察指标为共有峰的保留时间、相对峰面积和各谱图之间的相似度。经计算，结果显示，各共有峰的相对保留时间RSD值小于1.2%；各共有峰的相对峰面积值的RSD值小于1.3%。应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012，以第一次进样所得UPLC指纹图谱为参照谱计算6次进样所得UPLC谱图的相似度，结果显示相似度均大于0.99，符合指纹图谱分析的要求。表明该仪器及方法的精密度良好。

2.1.2 重复性试验

取同一批次银翘散6份，按照“1.3”项下所描述的方法制备供试品试液，然后按照“1.2”项下描述的方法进行UPLC色谱图采集。考察指标为共有峰的保留时间、相对峰面积和各谱图之间的相似度。经计算，结果显示，各共有峰的相对保留时间RSD值小于1.4%；各共有峰的相对峰面积值的RSD值小于1.5%。应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012，以第一次进样所得UPLC指纹图谱为参照谱计算6份银翘散样品的UPLC谱图的相似度，结果显示，相似度均大于0.99，符合指纹图谱分析的要求，表明该仪器及方法的重复性良好。

2.1.3 稳定性试验

取同一批次银翘散1份，按照“1.3”项下所描述的方法制备供试品试液，然后按照“1.2”项下描述的方法于供试品溶液制备好的时间开始 0 h， 5 h， 10 h， 15 h， 20 h， 25 h 进行6次UPLC色谱图采集。考察指标为共有峰的保留时间、相对峰面积和各谱图之间的相似度。经计算，结果显示，各共有峰的相对保留时间RSD值小于1.2%；各共有峰的相对峰面积值的RSD值小于1.3%。应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012，以第一次进样所得UPLC指纹图谱为参照谱计算6次进样所得UPLC谱图的相似度，结果显示，相似度均大于0.99，符合指纹图谱分析的要求。表明供试品溶液在 25 h 内其化学成分是稳定的。

2.2 银翘散指纹图谱的建立及相似度分析

分别取27批次银翘散按照“1.3”项下描述的方法制备供试品试液，按照“1.2”项下描述的的方法进行UPLC指纹图谱采集。将所得27个UPLC指纹图谱数据以AIA文件的格式导出，再将所导出的AIA文件导入到中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012。以1号样品所得UPLC色谱图为参照谱，先对所有UPLC色谱图进行多点校正，再进行自动匹配，然后生成对照指纹图谱，对照指纹图谱为图1中的R，最后进行相似度计算。如图2所示，27批次银翘散在该条件下UPLC指纹图谱有20个共有峰。各批次银翘散样品UPLC指纹图谱与对照指纹图谱比较，相似度在0.906～0.996之间。

2.3 共有峰峰面积主成分分析

应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对UPLC指纹图谱进行相似度计算时，其着重点在于计算各谱图间的相似程度。该算法中共有峰的峰面积越大，其权重也越大，那么计算出来的相似度结果很大程度上是由那些含量高的成分决定的。但是，不同厂家不同批次之间样品质量间存在的差异大多数时候是由一些含量不高的成分的不同而产生的，而这些细微的差别相似度评价系统就不能对其进行很好的评估。而主成分分析则可以对各样品间存在的细微差别进行有效的评估。本研究应用27批次银翘散UPLC指纹图谱的20个共有峰的相对峰面积数据为评价参数，应用SPSS 23 软件进行主成分分析。结果显示，累积载荷平方和取前3个主成分的话，其值为83.46%，能够很好的反应银翘散20个共有峰数据的基本信息。于是，取前三个主成分做因子得分图和因子载荷图。27批次银翘散所得数据的因子得分图(图3A)显示，3个不同厂家的银翘散能明显区分开来，说明不同厂家银翘散可能因为原材料的产地不同，其品质是存在差异的。因子载荷图(图3B)解释了产生银翘散品质差异的原因，20个共有峰对此都有一定的贡献。其中，贡较大的有离原点较远的共有峰4、共有峰10、共有峰11等，贡献较小的是离原点最近的共有峰7、共有峰5等。该结果显示，引起银翘散品质差异的原因主要是不同厂家产品中各共有峰代表的化合物在产品中含量的差异，该差异最可能的产生原因是不同厂家原材料生产地的不同。

2.4 共有峰峰面积聚类分析

为印证主成分分析结果的可靠性，将27批次银翘散指纹图谱的20个共有峰峰面积数据导入到SPSS 23 软件中，进行系统聚类分析。分析结果显示，与主成分分析结果相呼应，三个不同厂家的产品是能够明显区分开来的。除此之外，聚类分析还可以得到更加详细的组间及组内信息。从图4看出，厂家3和厂家1产品之间的相似度更高一些，而厂家2的产品与以上两家产品之间的差异要大一些。还能看出同一厂家不同批次产品之间存在的细微差异，如厂家3的产品23号与24号之间几乎没有差异，而它们与19号、20号、22号产品之间就有一定的差异。

3 结论

本研究考察了5种不同型号的色谱柱的分离效果，发现Agilent ZORBAX SB-C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm) 色谱柱的分离效能最好，能将样品中的特征峰都洗脱出来且分离度良好，于是后续试验都是用该色谱柱进行指纹图谱采集的。

在流动相的选择时，本研究考察了不同的流动相系统，最后采用了分离效能最好的0.02% 磷酸水(A)-乙腈(B)系统，进行梯度洗脱。该系统能将样品中所有特征峰在 24 min 内全部洗脱出来，且基本能达到有效分离。

因银翘散是由10味中草药组成的中成药，其中化学成分的复杂是不言而喻的，为了让UPLC指纹图谱能最大程度的反映出银翘散中的各种化学成分，本研究应用DAD检测器先对样品进行全扫描，对比各峰在不同波长下的吸收强度，经综合比较得出在 230 nm 处，各峰都能显示出来且能达到有效分离效果，所以最终确定UPLC指纹图谱的采集波长为 230 nm。

在对最终采集的UPLC图谱进行分析的时候，本研究采用了三种方法。方法一为传统的相似度法，应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所得谱图进行多点校正、自动匹配后再进行相似度计算。结果显示，产自3个厂家的27批次银翘散相似度在0.906～0.996之间，相似度良好。该方法对于确定一个未知样品到底是不是某一类物质有很好的辨识度，但是对于同一类物质之间存在的细微差异却是无能为力的。而主成分分析结果显示，来自不同厂家的样品可以完全区分开来，该方法能够将同类物质间存在的细微差异显示出来，且还能根据载荷图找到引起这些差异的原因，聚类分析的结果进一步验证了主成分分析的结果。如此，在对中药材进行质量评估的实际工作中，可以将三种分析方法结合起来，相似度法可以简单有效的确定某一样品到底是不是目标物，主成分分析法和聚类分析法可以用来辨别同类物质之间是否存在系统性差异。这样就能在实际工作中有效的辨别中药材的类别和品质。