黄酮类化合物与乙肝病毒蛋白的分子对接研究

姜云鸽,席晓萌,黄相中,田 凯

云南民族大学 化学与环境学院 民族药资源化学国家民族事务委员会-教育部重点实验室,云南 昆明 650500

乙型肝炎是乙肝病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染人体引起的高传染性疾病。病毒入侵人体后会持续复制,造成肝脏病变,进而引发肝硬化、肝细胞癌等疾病[1],乙肝是十大致死疾病之一[2-3],目前没有彻底治愈乙肝的方法,一般将抑制病毒持续复制作为治疗方案[4]。临床治疗乙肝的药物大多被发现存在降低耐药屏障、耐药变异、肾毒性、停药反弹等情况,难以彻底清除病毒,且对人体机能产生较大的负面影响[5-6],因此寻找更高效安全的新型抗乙肝病毒药物是十分必要的。

黄酮类化合物以2-苯基色原酮为骨架构建[7],常连接醇羟基、甲基等官能团,可分为黄酮、异黄酮类、黄烷酮类等15种类别之多[8],取代基的位置和数目都会影响其抗病毒活性[9],其普遍存在于天然植物、中药材当中,毒副作用小,具有抗炎、防氧化、抗过敏等多种功能[10-12]。研究证明,黄酮类化合物有降血压、防治心脑血管疾病、体内外抗病毒等多种药理活性,药用价值高[13-15]。这类化合物可抑制HBV表面抗原分泌、阻断DNA的复制及合成、调节免疫系统,从而减缓感染进程[16]。

本研究共使用35个黄酮类化合物小分子进行对接,这些化合物均由云南民族大学民族药资源化学国家民族事务委员会-教育部重点实验室在辣木、半育耳蕨、野番豆等天然中药材中获取有效活性成分及相应的化学结构,用于后续对接。根据文献查阅,发现35个化合物中大部分都具有较好的护肝抗炎的作用,例如:7-O-甲基圣草酚、樱花素、球松素具有较好的抗病毒和抗炎活性,而且球松素还具有较好的修复肝损伤的作用；紫铆黄酮具有抗肝纤维化作用与保肝作用,还能激活PI3K-Akt信号通路[17]；漆黄素可以抗肝炎,且对肝脏炎性损伤具有保护作用；羟基芜花素对肝癌细胞的增殖等具有明显的抑制作用等[18]。安全低毒、新型高效抗病毒的药物是目前治疗乙肝药物研发的主流目标,根据黄酮类化合物具有的特性,可以将其作为研制新型抗乙肝病毒药物的活性成分。

分子对接(molecular docking)基于“锁钥原理”,确定配体与受体的取向、位置与结合模式,研究其构象及变化[19-20]。在药物设计中,分子对接技术可以高效准确地筛选出与受体蛋白有较好亲和力的类药小分子,从中发现药物研发的先导化合物,在新药设计中具有重要意义[21]。分子对接可同时进行大批量快速筛选,缩短实验周期,成本低且准确率高,能减少科研的盲目性与偶然性,已成为研发新药物的基础[22],利用计算机辅助药物设计帮助新药研发也成为科研热点之一。本文采用Discovery Studio 2.5软件的Libdock模块进行对接分析。

本文将目前临床使用较为广泛的三种抗乙肝病毒药物恩替卡韦、拉米夫定与乙肝病毒蛋白进行对接,获取对接比分及活性位点,再将实验室获取的黄酮类化合物与乙肝病毒蛋白进行分子对接,最后将黄酮类化合物与抗乙肝病毒药物的对接结果进行比对,筛选出对接结果较好的黄酮类化合物,分析实验室获取的黄酮类化合物是否具有抗乙型肝炎病毒的作用,为新型乙型肝炎抑制剂药物的研发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 配体小分子的预处理

本实验中,拉米夫定、恩替卡韦、阿德福韦酯三种药物的结构可以直接通过有机小分子生物活性数据库PubChem下载MDL SDfile(*.sdf)格式文件,将35个黄酮类化合物的平面结构直接用ChemDraw Ultra 14.0软件分别画出,保存为(*.sdf)格式文件。再将小分子结构文件导入Discovery Studio 2.5中,进行加氢、能量优化等操作,并重新保存文件。通过DS将35个文件整合,对接时一次性选择所有配体结构,完成批量对接操作[23]。

1.2 受体蛋白的预处理

在本文的计算过程中,所使用的乙型肝炎病毒蛋白结构是通过RCSB PDB数据库获取的。以“Hepatitis B virus”作为关键词,检索并下载相应PDB格式的蛋白结构。本文使用的是人类乙型肝炎病毒衣原体蛋白(PDB:1QGT)进行后续分子对接研究,将1QGT结构导入DS软件中,去水加氢、去除蛋白多构象、补充非完整氨基酸残基,保存作为对接受体蛋白。

1.3 分子对接仿真运行

进行对接之前,需将处理后的蛋白定义为受体。软件会自动筛选出受体的潜在有效结合位点,对接时需定义位点的球形区域进行后续对接。每个位点须单独定义,球形区域之间不能重叠且要完全包含结合位点的前提下尽量小,这样有助于提高对接的准确度还能尽量缩短仿真分子对接的计算时间。

通过DS软件中的Protocols面板的Dock Ligand(Libdock)模块对预处理后的乙肝病毒受体蛋白与三种抗乙肝药物、复合黄酮类化合物小分子文件分别进行分子对接,设定对接参数,最后进行结果分析。

2 对接结果与分析

DS软件会自动查找并筛选出所有潜在的活性位点并按照活性大小由高向低排序,并通过内置算法评估每个位点区域与受体蛋白的结合程度,并给出对接比分Libdock Score。Libdock Score是对能量、几何形状、化学环境综合评价的参数,分数越高,证明配体与受体的结合程度越好且结合模式较优,相互作用也越强。

2.1 抗乙肝病毒药物与受体蛋白对接结果与分析

DS软件一共获取了受体蛋白的8个位点,分别构建球形区域对接。利用DS软件分别选取三种药物的结构作为配体与受体蛋白1QGT进行对接,经过分子仿真模拟对接后,发现在与三种抗乙肝药物的对接中,只有Site 3这一位点与三种药物小分子对接分数(吻合度Libdock Score)较高,因此选取Site 3的对接结果分析,最高分如表1示。由表1得,在位点Site 3中,阿德福韦酯分子与1QGT对接分数最高,说明二者结合程度最好,有很强的相互作用。为便于观察与分析相互作用,将三种药物对接结果最高分进行二维与三维可视化。

表1 三种抗乙肝病毒药物对接最高分

图1为阿德福韦酯与1QGT对接结果图。阿德福韦酯与蛋白残基TRP102、SER106、SER121、THR128形成5个氢键,具有极强的氢键作用；与TRP125、LEU140、TYR132形成碳氢键；PRO134、ARG133的阳离子与苯环π电子间存在p-π共轭效应；ARG127、PRO25、LEU30、VAL124、PHE110、ILE105、TYR38、LEU37与烷基产生了π-烷基作用；阿德福韦酯与氨基酸PHE122、PRO138、SER141、ILE139、TYR118、THR142、VAL120、PHE23、THR109、THR33、PHE18、PHE24、PRO129存在较强的疏水作用,推测THR128、PRO134、VAL124、PRO25、LEU30可能在阿德福韦酯分子与1QGT的相互作用中起到关键作用。

图1 阿德福韦酯与1QGT Site3对接二维图与三维图

图2为恩替卡韦与1QGT对接结果图。恩替卡韦与蛋白残基TRP102、LEU140、SER106形成3个氢键,有很强的氢键作用；与TYR132、TRP102形成碳氢键；PRO25和LEU30的阳离子与苯环π电子间存在p-π共轭效应；PHE23、PRO129与烷基产生了π-烷基作用；恩替卡韦与氨基酸ILE139、THR128、PHE24、TYR118、ARG133、LEU101、ILE105、VAL124、ASP29、THR33、ARG127存在较强疏水作用,推测LEU140、TRP102、PRO25可能在恩替卡韦分子与1QGT的相互作用中起到关键作用。

图2 恩替卡韦与1QGT Site3对接二维图与三维图

图3是拉米夫定与1QGT对接结果图。拉米夫定与蛋白残基TYR118、LEU140、PHE23、THR128形成4个氢键,具有极强的氢键作用；与TYR132、PRO129形成碳氢键；PHE23、PRO25、LEU140的阳离子与苯环π电子间存在p-π共轭效应；TRP102的阴离子与配体苯环形成共轭效应；拉米夫定与氨基酸ARG133、ILE139、PRO134、TRP125、VAL124、SER106、PHE24存在较强的疏水作用,推测PHE23、LEU140可能在拉米夫定分子与1QGT的相互作用中起到关键作用。

图3 拉米夫定与1QGT Site3对接二维图与三维图

2.2 黄酮类化合物与乙肝病毒蛋白对接结果

经过黄酮类化合物文件和受体蛋白的分子仿真模拟对接,发现黄酮类化合物与三种抗乙肝病毒药物一样,都与Site 3位点结合分数最高,35个黄酮类化合物对接最高分结果如表2示。由表2知,在Site 3中,HT28与1QGT的对接分数最高,说明二者结合程度最好,其次表中HT10、HT1等配体的对接比分也都较高,说明它们与受体蛋白也有较强的相互作用。为便于观察与分析相互作用,将排名前三的结果进行二维与三维可视化(见图4)。

表2 黄酮类化合物Site3对接结果分数表

图4 35个黄酮类小分子与1QGT蛋白3号位点分子对接示意图

图5为HT28与1QGT对接结果图。HT28与蛋白残基ILE139、VAL124、THR33、PRO134形成碳氢键；PRO25、LEU140和LEU30的阳离子与苯环π电子间存在p-π共轭效应；HT28与氨基酸ARG133、TYR132、TYR118、PHE23、PHE24、THR128、SER106、TRP102、PRO129、ALA34、ILE105、LEU101、ASP29、PHE18、ARG127、PHE110、TRP125、GLY123存在较强疏水作用,推测LEU140、PRO25、LEU30可能在HT28与1QGT的相互作用中起到关键作用。

图5 HT28与1QGT Site3对接二维图与三维图

图6为HT10与1QGT对接结果图。HT10与蛋白残基PHE23、TYR118形成2个氢键,具有较强的氢键作用；与LEU30、PRO25形成了一些较弱的碳氢键；PRO25、ILE105、LEU30、PRO129的阳离子与苯环π电子间存在p-π共轭效应；PHE23与配体芳香环形成稳定的π-π疏水堆积作用；HT10与氨基酸TYR132、ILE139、LEU140、SER106、TRP102、VAL124、ARG127、ASP29、THR33、ALA34、LEU101、THR128、PHE24、PHE110存在较强疏水作用,推测PHE23、PRO25、LEU30可能在HT10与1QGT的相互作用中起到关键作用。

图6 HT10与1QGT Site3对接二维图与三维图

图7为HT1与1QGT对接结果图。HT1与蛋白残基PHE23、TYR118形成2个氢键,具有较强的氢键作用；与LEU30、PRO25形成了一些较弱的碳氢键；PRO25、ILE105、LEU30、PRO129的阳离子与苯环π电子间存在p-π共轭效应；PHE23与配体芳香环形成稳定的π-π疏水堆积作用；HT1与氨基酸TYR132、ILE139、LEU140、SER106、TRP102、VAL124、ARG127、ASP29、THR33、ALA34、LEU101、THR128、PHE24存在较强疏水作用,推测PHE23、PRO25、LEU30可能在HT1与1QGT的相互作用中起到关键作用。

图7 HT1与1QGT Site3对接二维图与三维图

3 结 论

本文主要基于分子对接技术,将应用广泛的三种抗乙肝病毒药物与乙肝病毒蛋白进行对接,通过对接软件确定潜在活性位点,探究了药物分子与蛋白质的结合模式与相互作用关系,再将35种实验室获得的黄酮类化合物与人类乙型肝炎病毒衣原体蛋白1QGT进行对接模拟计算,从而探究黄酮类化合物是否具有抗乙肝病毒的作用。通过对结果的分析比较,发现黄酮类化合物与三种抗乙肝病毒药物进行作用的乙肝病毒蛋白位点相同且作用残基大部分都是相同的,其中与受体相互作用种类多且作用较强的共同残基主要有:PHE23、LEU140、PRO25、PRO134等,推断它们可能为受体的活性位点残基；通过进一步筛选对接结果,发现HT28、HT10、HT11这3个黄酮类化合物与乙肝病毒蛋白的对接最高分数都在127分以上,均远超过了拉米夫定与恩替卡韦两种药物的对接最高分,仅次于药物阿德福韦酯,说明这3个黄酮类化合物可能对乙肝病毒起到较强的抑制作用,是比较好的抗乙肝病毒的活性成分,可以用于新药物的后续研发。而其他分数略高于拉米夫定和恩替卡韦两种药物的黄酮类化合物如HT11、HT23、HT24等,通过结构的修饰改性,或许在后续实验中也能有比较好的抗病毒效果。通过上述结果分析,我们能够合理推测,实验选取的部分黄酮类化合物作为乙型肝炎病毒抑制剂具有一定的可行性,或许未来黄酮类化合物能够成为新型抗乙肝病毒药物的活性成分。这也说明利用分子对接方法进行药物的虚拟筛选从而进行后续相关实验是可靠的,能为研发新型抗乙肝病毒药物提供一定的理论依据。