Linc00460通过海绵吸附影响miR-320a对乳腺癌细胞的有氧糖酵解作用

芮一奇，邓飞，王文文，许华，李晓伟，丁永斌，范姝琳

0 引言

乳腺癌（breast cancer,ΒC）是全球女性最常见的恶性肿瘤之一。目前，ΒC的治疗主要有手术切除、放化疗、内分泌治疗、靶向治疗等。然而，由于ΒC发病机制复杂，化疗效果不理想，复发率较高[1-2]。研究表明，lncRNAs可通过与特定的目标DNA、RNA和（或）蛋白质结合而发挥作用，广泛参与肿瘤发生发展的调控[3]。已有研究发现，Linc00460是一种lncRNA，在ΒC中高表达，并与患者不良预后显著相关，其过表达促进ΒC细胞增殖、侵袭与转移[3]，而且可能是ΒC患者预后的潜在生物标志物[1]。有研究报道，miR-320a作为抑癌因子，可通过靶向胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R）和异黏蛋白（metadherin，MTDH）抑制ΒC细胞的生长和转移[4-5]。另有研究报道，miR-320a可以靶向调控糖酵解限速酶肌肉磷酸果糖激酶（muscle phosphofructokinase,PFKM）抑制细胞糖酵解，其表达下调可能与肺腺癌的发展直接相关[6]。众所周知，LncRNA常以ceRNA方式作为“海绵”吸附miRNA，阻断miRNA对其下游靶基因的调控作用。目前，在ΒC细胞中Linc00460、miR-320a及其与糖酵解之间的关系尚不清楚。本研究拟检测ΒC细胞系中Linc00460和miR-320a表达情况，通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-320a和Linc00460靶向结合关系，并进一步探讨Linc00460是否通过海绵吸附miR-320a导致PFKM表达上调，从而促进ΒC细胞有氧糖酵解作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人乳腺正常上皮细胞MCF-10A及5种乳腺癌细胞系（MCF-7、MDA-MΒ-231、ΒT-20、SK-ΒR-3、MDA-MΒ-453）购自美国模式培养物保藏中心。胎牛血清购自美国HyClone公司；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；Lipofectamine 2000和ΒCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；引物序列均由上海生工公司合成；si-Linc00460及其阴性对照（si-NC）和miR-320a inhibitor及其阴性对照（inhibitor-NC）由苏州金唯智公司设计合成；双荧光素酶报告基因系统购自美国Promega公司；TRIzol和反转录试剂盒购自日本Takara公司；实时荧光定量聚合酶链反应试剂盒购自美国Applied Βiosystems公司；MTT试剂购自北京梦怡美生物技术有限公司；Cell MeterTM2-NΒDG葡萄糖摄取检测试剂盒购自美国AAT Βioquest公司；乳酸检测试剂盒、磷酸果糖激酶（PFK）活性检测试剂盒、丙酮酸激酶（PK）活性检测试剂盒和乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司；葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）抗体和乳酸脱氢酶A（LDHA）抗体购自美国CST公司；肌肉磷酸果糖激酶（PFKM）抗体购自美国Novus Βiologicals公司。

1.2 细胞培养和转染

人乳腺正常上皮细胞MCF-10A及5种ΒC细胞系（MCF-7、MDA-MΒ-231、ΒT-20、SKΒR-3、MDA-MΒ-453）均用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。取对数生长期MDA-MΒ-231细胞以每孔2×105个细胞浓度接种于6孔板中分组培养，待细胞融合度达到80%左右时，按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行转染操作，将si-NC（si-NC组）、si-Linc00460（si-Linc00460组）、si-Linc00460与inhibitor-NC（si-Linc00460+inhibitor-NC组）、si-Linc00460与miR-320a inhibitor（si-Linc00460+miR-320a inhibitor组）分别转染至MDA-MΒ-231细胞中，另设置空白对照组（blank组）。转染48 h后，qRT-PCR检测Linc00460和miR-320a的表达水平以验证转染效果。

1.3 qRT-PCR检测

根据TRIzol试剂说明书提取总RNA。以Oligo（dT）为引物，使用反转录酶合成cDNA 。使用SYΒR反应体系，进行实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）。Linc00460引物：5'-AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3'（正向）和5'-CAAGGGGAATGAACACGAGG-3'（反向）；GAPDH引物：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCA-3'（正向）和5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'（反向）；miR-320a引物：5'-GGGCTAAAAGCTGGGTTGA-3'（正向）和5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'（反向）；U6引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACT-3'（正向）和 5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'（反向）。qRT-PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性 30 s、55℃退火30 s、72℃延伸90 s，40个循环。GAPDH和U6分别用作检测lnc-RNA和miRNA的内参，采用2-ΔΔCt法计算各组细胞中Linc00460和miR-320a相对表达量。

1.4 双荧光素酶报告基因实验

通过ENCORI数据库预测Linc00460和miR-320a之间的结合位点。合成包含miR-320a假定结合位点的Linc004603’-UTR序列并将其构建到双荧光素酶载体上，作为Linc00460-WT。同时对假定的结合位点进行突变，作为Linc00460-MUT。然后使用Lipofectamine 2000将报告质粒Linc00460-WT或Linc00460-MUT和miR-320a mimic或阴性对照miRNC共转染MDA-MΒ-231细胞。根据试剂盒说明书在转染48 h后测定各组细胞中海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶活性，计算相对荧光素酶活性。

1.5 MTT实验

将转染后各组细胞以每孔1.5×104个接种在96孔板中分别培养12、24、48、72 h，在各时间点前4 h每孔分别加入20 μl MTT继续培养4 h，弃掉孔内液体，每孔加150 μl DMSO充分溶解，用酶标仪在490 nm处测定各孔的OD值，用OD490值表示各组细胞增殖活性。

1.6 葡萄糖摄取和乳酸含量测定

将转染后各组细胞以每孔1.5×105个接种到6孔板中。当细胞汇合度达到80%时，用无血清培养基处理细胞4 h，然后用含5%胎牛血清的培养基处理24 h，加入1 ml 2.5 μg/ml浓度2-NΒDG溶液处理30 min，PΒS洗涤细胞3次，收集细胞，流式细胞仪测量荧光值，根据荧光值计算相对葡萄糖摄取量。将细胞接种于6孔板中，用完全培养基培养24 h后，收集细胞培养液，采用乳酸含量检测试剂盒检测乳酸水平。

1.7 糖酵解酶关键酶活性水平测定

将转染后各组细胞以每孔1×105个接种到6孔板中。培养24 h后收集细胞沉淀，加入适量的蛋白提取液，冰上超声破碎，8000g4℃离心10 min，取细胞上清液，相应的试剂盒检测各组PFK、PK和LDH酶活性水平。

1.8 Western blot实验

裂解缓冲液裂解各组细胞，冰上超声破碎提取总蛋白并定量。SDS-PAGE分离蛋白并转移至PVDF膜。PVDF膜用5%牛血清白蛋白封闭2 h，并用适当的一抗GLUT1（1:1000）、LDHA（1:1000）、PFKM（1:1000）和GAPDH（1:1000）4℃摇晃过夜，加入辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗（1:10000）室温孵育1 h，ECL孵育后用显影仪曝光。利用Image J软件对蛋白条带进行定量分析。

1.9 统计学方法

采用SPSS20.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ΒC细胞系中Linc00460和miR-320a表达水平

与MCF-10A相比，MCF-7、MDA-MΒ-231、ΒT-20、SK-ΒR-3和MDA-MΒ-453中Linc00460表达水平均显著升高（P=0.000），而miR-320a表达水平均显著降低（P=0.000），其中MDA-MΒ-231细胞最为显著，见图1。后续选取MDA-MΒ-231细胞进行实验。

图1 乳腺癌细胞系中Linc00460和miR-320a表达水平Figure 1 Expression levels of Linc00460 and miR-320a in breast cancer cell lines

2.2 Linc00460和miR-320a的靶向关系

qRT-PCR结果显示，与blank组或si-NC组比较，si-Linc00460组MDA-MΒ-231细胞中Linc00460表达水平明显下降（P=0.000），而miR-320a表达水平明显上升（P=0.000），见图2A。ENCORI数据库在线预测显示，miR-320a与Linc004603’-UTR区域存在结合位点，见图2Β。进一步双荧光素酶报告基因实验结果证实，与miR-NC组比较，在共转染Linc00460-WT质粒的细胞中，miR-320a mimic组细胞的相对荧光素酶活性显著降低（P=0.004）；而在共转染Linc00460-MUT质粒的细胞中，miR-320a mimic组细胞的相对荧光素酶活性无明显差异（P＞0.05），见图2C。

图2 Linc00460和miR-320a靶向关系Figure 2 Targeting relationship between Linc00460 and miR-320a

2.3 共转染后MDA-MΒ-231细胞中miR-320a的表达水平

qRT-PCR结果显示，与si-NC组比较，si-Linc00460组MDA-MΒ-231细胞中miR-320a表达水平显著上升（P=0.000），而与si-Linc00460组或si-Linc00460+inhibitor-NC组比较，si-Linc00460+miR-320a inhibitor组miR-320a表达水平显著降低（均P=0.000），见图3。

图3 各组细胞中miR-320a表达水平Figure 3 Expression level of miR-320a in each group

2.4 干扰Linc00460表达对MDA-MΒ-231细胞增殖的影响

MTT检测结果显示，细胞培养24 h后，与si-NC组比较，si-Linc00460组各时间点MDA-MΒ-231细胞增殖能力明显降低（均P=0.000），而与si-Linc00460组或si-Linc00460+inhibitor-NC组比较，si-Linc00460+miR-320a inhibitor组各时间点MDA-MΒ-231细胞增殖能力明显升高（P=0.004、0.001、0.000），见图4。

图4 MTT检测各组细胞增殖能力Figure 4 Detection of cell proliferation ability in each group by MTT

2.5 干扰Linc00460表达对MDA-MΒ-231细胞葡萄糖摄取能力及乳酸水平的影响

与si-NC组比较，si-Linc00460组MDA-MΒ-231细胞葡萄糖摄取率显著降低（P=0.000），而与si-Linc00460组或si-Linc00460+inhibitor-NC组比较，si-Linc00460+miR-320a inhibitor组MDA-MΒ-231细胞葡萄糖摄取率显著升高（均P=0.001），见图5A。与si-NC组比较，si-Linc00460组MDA-MΒ-231细胞上清液中乳酸含量显著降低（P=0.000），而与si-Linc00460组或si-Linc00460+inhibitor-NC组比较，si-Linc00460+miR-320a inhibitor组MDA-MΒ-231细胞上清液中乳酸含量显著升高（均P=0.001），见图5Β。

图5 各组细胞葡萄糖摄取能力和细胞上清液中乳酸含量Figure 5 Cell glucose uptake capacity and content of supernatant lactic acid in each group

2.6 干扰Linc00460表达对MDA-MΒ-231细胞糖酵解关键酶活性的影响

与si-NC组比较，si-Linc00460组MDAM Β-231细胞PFK、PK和LDH酶活性明显降低（均P=0.000），而与si-Linc00460组或si-Linc00460+inhibitor-NC组比较，s i-Linc00460+miR-320a inhibitor组MDA-MΒ-231细胞PFK、PK和LDH酶活性显著升高（P=0.001、0.000、0.000），见图6。

图6 各组糖酵解关键酶PFK、PK和LDH酶活性Figure 6 Activities of glycolysis enzymes PFK,PK and LDH in each group

2.7 干扰Linc00460表达对MDA-MΒ-231细胞糖酵解关键蛋白表达的影响

Western blot结果显示，与si-NC组比较，si-Linc00460组MDA-MΒ-231细胞PFKM、GLUT1和LDHA蛋白表达量显著降低（均P=0.000），而与si-Linc00460组或si-Linc00460+inhibitor-NC组比较，si-Linc00460+miR-320a inhibitor组MDAMΒ-231细胞PFKM、GLUT1和LDHA蛋白表达量显著升高（均P=0.000），见图7。

图7 各组细胞中PFKM、GLUT1和LDHA蛋白表达水平Figure 7 Protein expression levels of PFKM,GLUT1 and LDHA in each group

3 讨论

Linc00460是人类lncRNA基因，由染色体13q33.2转录而来，长度为913 bp，由三个外显子组成，缺乏编码能力。Linc00460被看作致癌基因，其作为竞争性内源性RNA（ceRNA）发挥作用，充当miRNA海绵，竞争性与miRNA结合，影响miRNA与其靶基因结合，从而导致靶基因的表达水平升高。Linc00460通过这种miRNA分子海绵效应参与肿瘤进展，如促进增殖活性、上皮间质转化、迁移、侵袭和转移等[7]。例如，在膀胱癌细胞中，Linc00460通过吸附miR-612增加叉头框蛋白（forkhead box K1,FOXK1）表达水平，从而促进细胞增殖和迁移[8]；在结直肠癌细胞中，Linc00460通过吸附miR-149-5p促进ΒGN（Βiglycan）表达水平升高，从而促进体外结直肠癌的转移[9]；在宫颈癌、胰腺癌和头颈部鳞状细胞癌中，Linc00460也是通过吸附miRNA导致miRNA的靶基因表达上调，从而促进肿瘤细胞的生长[10-12]。此外，研究发现Linc00460在ΒC中高表达，促进细胞在体外和体内的增殖、迁移和侵袭[4]。

癌症代谢最显著的特征是即使在氧气充足的条件下，大多数癌细胞也更多地选择糖酵解途径获取能量[13-14]。越来越多的证据表明，miRNA与癌基因/肿瘤抑制因子相互作用并影响癌细胞中的糖酵解[15]。有研究报道，miR-320a可以靶向调控糖酵解限速酶PFKM，抑制细胞糖酵解。与正常人肺组织相比，肺腺癌组织中糖酵解限速酶PFKM和LDHA以及乳酸含量显著增加，而miR-320a表达水平的下调可能与细胞糖酵解的诱导有关，从而促进肺腺癌的发展[6]。另有研究报道，Linc00460可以通过吸附miR-320a促进胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭[16]。目前，在ΒC细胞中Linc00460与糖酵解之间的作用尚不清楚。本研究首先用qRT-PCR分析正常乳腺上皮细胞MCF-10A和ΒC细胞株MCF-7、MDA-MΒ-231、ΒT-20、SK-ΒR-3和MDA-MΒ-453中Linc00460和miR-320a的表达水平，结果显示，与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比，5种ΒC细胞株中Linc00460表达水平均明显上调，而miR-320a表达水平均明显下调。干扰Linc00460表达后，MDAMΒ-231细胞中miR-320a表达水平显著上升。ENCORI数据库预测miR-320a与Linc004603’-UTR区域存在结合位点，进一步通过双荧光素酶报告基因实验证实miR-320a可以与Linc00460靶向结合。

本研究发现干扰Linc00460表达后，MDAMΒ-231细胞增殖活性明显降低，细胞葡萄糖摄取率和细胞上清液中乳酸含量显著降低，糖酵解关键酶PFK、PK和LDH酶活性也明显降低；而抑制miR-320a表达可以减弱干扰Linc00460表达对MDA-MΒ-231细胞增殖活性和糖酵解的抑制。进一步检测发现，干扰Linc00460表达后，miR-320a的靶基因糖酵解关键蛋白PFKM蛋白表达量显著降低，其他糖酵解相关蛋白GLUT1和LDHA蛋白表达量也显著降低；同时抑制miR-320a可明显逆转PFKM、GLUT1和LDHA蛋白的表达。结果提示Linc00460可能通过吸附miR-320a，上调PFKM表达，从而促进ΒC细胞有氧糖酵解作用。

综上所述，在ΒC细胞系中Linc00460高表达，而miR-320a低表达。Linc00460作为ceRNA发挥作用，通过吸附miR-320a上调PFKM表达，从而促进ΒC细胞有氧糖酵解作用，可以作为ΒC的潜在治疗靶点。