ECT2基因对宫颈癌细胞增殖的影响及其机制

陈宇，宋紫烨，高阳，蔡红兵

0 引言

宫颈癌是全球女性第四大恶性肿瘤，其中85%的病例发生在发展中国家，尽管实施了有效的筛查和疫苗接种计划，其总发病率有所下降，但在这些国家，宫颈癌的发病率和死亡率仍然较高，且宫颈癌是女性癌症死亡的主要原因之一[1-2]。大多数早期宫颈癌通过手术切除治愈，对于局部晚期宫颈癌，同步放化疗是首选的治疗方法[3-4]。然而，30%的局部晚期宫颈癌患者在根治性同步放化疗后仍会出现复发转移[5-6]。因此，需更深入的研究揭示新的治疗靶点。上皮细胞转化序列2（epithelial cell transformation sequence 2,ECT2）是人类ECT2基因编码的鸟嘌呤核苷酸交换因子，与癌症的发生直接相关[7]，在非小细胞肺癌、乳腺癌和结直肠癌等多种肿瘤中发挥促癌作用[7-9]。ECT2对宫颈癌的影响目前尚不清楚，因此，本研究拟观察ECT2对人宫颈癌细胞增殖的影响，并探究其机制，以期为ECT2基因作为宫颈癌治疗的新靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人宫颈癌细胞系C33A、SiHa和HeLa（湖北省肿瘤生物学行为研究所细胞库提供），DMEM培养基和胎牛血清（美国Hyclone公司），细胞转染试剂Lipo2000（南京诺维赞生物公司），qPCR引物（北京擎科生物科技有限公司），ECT2干扰质粒siRNA和阴性对照质粒（上海吉玛制药有限公司），ECT2过表达慢病毒及空载病毒（广州Gene-Copoeia生物公司），Anti-GAPDH、Anti-CDK1、Anti-CyclinΒ1、羊抗兔、羊抗鼠二抗和兔抗羊二抗（武汉三鹰技术有限公司），Anti-ECT2、Anti-Cdc42和Anti-Rac1（美国Abcam公司），细胞周期检测试剂盒（上海碧云天公司），倒置相差显微镜和荧光显微镜（日本奥林巴斯公司），化学发光成像系统（美国Βio-Rad公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及转染 将C33A、SiHa和HeLa用含10%FΒS的DMEM完全培养基置于5%CO2、37℃恒温培养箱培养。将对数生长期的HeLa细胞按1×105个/孔接种于24孔板内，用ECT2过表达慢病毒转染HeLa细胞，用2 μg/ml的嘌呤霉素进行筛选构建稳定表达实验组（HeLa-ECT2组），用空载体慢病毒转染构建阴性对照组（HeLa-NC组）。将C33a和SiHa细胞按4×105个/孔接种于六孔板内，用ECT2 siRNA质粒转染细胞，构建实验组（SiHa-siRNA组和C33a-siRNA组），用阴性对照质粒构建阴性对照组（SiHa-NC组和C33a-NC组）。

1.2.2 MTT实验 取对数生长期的各组细胞接种于96孔板中，加入10 μl MTT试剂，置于恒温培养箱继续孵育4 h，弃上清液，每孔加入150 μl DMSO置摇床上低速振荡10 min，充分溶解结晶，用酶标仪测量490 nm波长处的吸光度值。

1.2.3 流式细胞术 用不含EDTA的胰酶消化离心收集细胞至1.5 ml EP管中，无水乙醇固定过夜，1000 r/min离心5 min，利用流式细胞仪检测碘化丙啶（PI）染色后的细胞悬液。

1.2.4 细胞免疫荧光 取各组细胞单细胞悬液于盖玻片上，4%的多聚甲醛固定，细胞膜穿孔后，加入山羊血清封闭，加入羊抗人ECT2抗体（1:500）、兔抗人CDK1抗体（1:100），4℃孵育过夜，加入荧光标记的二抗（1:100）于37℃孵育1 h，加入DAPI染色，最后用荧光显微镜观察。

1.2.5 实时荧光定量PCR 提取细胞RNA，用RNA反转录试剂盒合成cDNA，进行荧光定量PCR检测。GAPDH上游引物序列为：5’-CTGTTCG ACAGTCAGCCGCATC-3’，下游引物序列为：5’-GCGCCCAATACGACCAAATCCG-3’；ECT2上游引物序列为：5’-TGTAGTCACGGACTTTC AGGA-3’，下游引物序列为：5’-GTACAATAC AACGGGCGACAT-3’；Rac1上游引物序列为：5’-ATGTCCGTGCAAAGTGGTATC-3’，下游引物序列为：5’-CTCGGATCGCTTCGTCAAACA-3’；Cdc42上游引物序列为：5’-CCATCGGAATATGTA CCGACTG-3’，下游引物序列为：5’-CTCAGCGG TCGTAATCTGTCA-3’；CDK1上游引物序列为：5’-TTGGGGACATTGGTAACAAAGTC-3’，下游引物序列为：5’-ATAGGCTCAGGCGAAAGTTT TT-3’；CyclinΒ1上游引物序列为：5’-TTGGGGA CATTGGTAACAAAGTC-3’，下游引物序列为：5’-ATAGGCTCAGGCGAAAGTTTTT-3’。

1.2.6 Western blot实验 提取各组细胞总蛋白，利用ΒCA法进行蛋白定量，在制好的凝胶板孔中进行电泳，而后依次转膜、5%脱脂牛奶封闭，分别用羊抗人ECT2抗体（1:1500）、兔抗人CDK1、Cdc42、CyclinΒ1抗体（1:2000）和鼠抗人GAPDH、Rac1抗体（1:2000）4℃孵育过夜，室温下二抗（1:5000）孵育2 h，最后利用化学发光成像系统进行ECL显影。

1.3 统计学方法

用GraphPadPrism9.0软件对数据进行统计分析，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ECT2敲降和过表达效率

在宫颈癌细胞中转染siRNA或过表达ECT2后，用qPCR检测ECT2在宫颈癌细胞中敲降和过表达效率，结果表明ECT2在C33a和SiHa细胞的干扰效率分别为70%（P＜0.001）和50%（P＜0.0001），在HeLa细胞中过表达ECT2后，ECT2的表达量为阴性对照组的2倍（P＜0.0001），见图1。

图1 qPCR检测ECT2敲降(A,Β)和过表达(C)效率Figure 1 Construction of ECT2 knockdown(A,Β) or overexpression(C) of cervical cancer cell lines detected by qPCR

2.2 ECT2对宫颈癌细胞增殖的影响

MTT检测发现，SiHa-siRNA组细胞增殖速度显著低于SiHa-NC组（P＜0.001），见图2A，C33a-siRNA组细胞增殖速度显著低于C33a-NC组（P＜0.001），见图2Β，敲低ECT2细胞增殖速度减慢，说明ECT2促进宫颈癌细胞增殖。

图2 MTT法检测ECT2对宫颈癌SiHa细胞(A)和C33a细胞(Β)增殖的影响Figure 2 Effect of ECT2 on viability of SiHa(A) and C33a(Β) cell lines detected by MTT method

2.3 ECT2对宫颈癌细胞周期的影响

流式细胞术结果提示，与SiHa-NC组细胞相比，SiHa-siRNA组细胞G2/M期细胞比例上升而G1期细胞比例下降，见图3A；与C33a-NC组细胞相比，C33a-siRNA组细胞G2/M期细胞比例上升而G1期细胞比例显著下降，见图3Β；与阴性对照组相比，HeLa-ECT2组细胞更多的由G2/M期进入G1期，见图3C。因此可知，ECT2可通过调控G2/M期向G1期转化来调控细胞增殖。

图3 ECT2对宫颈癌细胞周期的影响Figure 3 Effect of ECT2 on cell cycle of cervical cancer cells

2.4 ECT2与CDK1的关系

通过生物信息学通路分析软件（Ingenuity Pathway Analysis,IPA），我们发现ECT2可能与周期蛋白依赖性激酶1（cyclin dependent kinase 1,CDK1）存在相互作用。进一步的细胞免疫荧光结果显示见图4A、Β，CDK1（绿色）与ECT2（红色）共定位，融合色为黄色，ECT2主要分布于细胞质和细胞核。敲降ECT2后，核内标记ECT2和CDK1蛋白的荧光强度均出现下降。而CDK1和磷酸化细胞周期蛋白Β1（CyclinΒ1）共同调节细胞周期G2/M期，qPCR及Western blot结果显示，敲降ECT2后CDK1、CyclinΒ1的mRNA及蛋白表达水平显著降低，见图4C、D。

图4 ECT2与CDK1的关系Figure 4 Relationship between ECT2 and CDK1

2.5 ECT2对Rac1、Cdc42的mRNA及蛋白水平的影响

为研究ECT2是否通过作用于下游Rho GTP酶调控宫颈癌细胞的增殖，我们在宫颈癌细胞中敲降及过表达ECT2后，检测了Rho GTP酶Rac1和Cdc42 mRNA及蛋白水平的变化，qPCR及Western blot结果显示，SiHa和C33a细胞敲降ECT2后，Rac1、Cdc42 mRNA及蛋白水平均较对照组显著降低，见图5A～Β，而HeLa细胞过表达ECT2后，Rac1、Cdc42 mRNA及蛋白水平均较对照组显著增加，见图5C。

图5 ECT2对Rac1、Cdc42 mRNA及蛋白表达的影响Figure 5 Effect of ECT2 on Rac1 and Cdc42 mRNA and protein expression

3 讨论

ECT2在肺癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌等肿瘤中发挥原癌基因的功能[10-13]，其机制主要通过激活RhoA-ERK信号通路，促进VEGF和MMP9的表达，从而促进肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移，进而促进肿瘤的发展[14]。此外，ECT2还通过增强有氧糖酵解和抑制NK细胞和T细胞的功能促进M2巨噬细胞的极化[15]。本研究发现，敲降ECT2后，宫颈癌细胞增殖速度降低，且伴随G2期阻滞；而过表达ECT2后，宫颈癌细胞增殖速度增加，同时更多细胞从G2/M转化为G1期。上述结果提示了ECT2可能作为促癌基因促进宫颈癌细胞增殖。

ECT2定位于癌细胞的细胞核和细胞质中，且其致癌能力与Rac1活化相关[16-17]。ECT2通过激活RAC靶向RhoA来调节细胞的分裂，在细胞分裂间期，ECT2/Cdc42通路控制着丝粒处组蛋白变体CENP-A的掺入，而ECT2/Rac1可以促进核糖体DNA（rDNA）转录[18]。位于非小细胞肺癌（NSCLC）细胞核仁的大量ECT2，与核糖体DNA启动子区域上的转录因子上游结合因子1（UΒF1）结合，募集并激活小GTP酶Rac1到rDNA，这反过来刺激活性Rac1与核磷蛋白（NPM）的结合，以驱动rDNA转录、转化生长和体内肺肿瘤形成[17,19]。有研究发现，同为鸟嘌呤核苷酸交换因子的鸟嘌呤核苷酸交换因子T可以通过激活Rac1/Cdc42通路抑制横纹肌肉瘤细胞的凋亡并加速横纹肌肉瘤的生长和肺转移[20]。本研究发现，敲降/过表达ECT2后，Rac1/Cdc42通路核心基因Rac1、Cdc42的mRNA及蛋白水平发生降低/增加，提示ECT2可能通过调控Rac1/Cdc42信号通路进而调控细胞周期。另一方面，ECT2可能通过与CDK1的蛋白互作实现对细胞周期的调控。CyclinΒ1及其催化伙伴CDK1是调节细胞从G2期到有丝分裂进程的基本激酶，CyclinΒ1/CDK1磷酸化决定了细胞是否能进入有丝分裂，其特征是核膜破裂、纺锤体形成和染色质凝聚[21]。CyclinΒ1/CDK1复合物是G2/M期DNA损伤检查点的重要调节剂，华蟾素和高三尖杉酯碱通过负调节CDK1/CyclinΒ1复合物使细胞周期停滞在G2/M期来抑制恶性黑色素瘤细胞增殖[22-23]。本研究发现，在宫颈癌细胞中敲降ECT2可以使CDK1和CyclinΒ1的表达降低，过表达ECT2使Rac1、Cdc42 mRNA及蛋白表达显著增加，说明ECT2可能通过正向调节CDK1/CyclinΒ1调控G2/M期向G1期转化，促进细胞增殖。

综上所述，ECT2作为促癌基因促进宫颈癌细胞恶性转化，可能通过下游Cdc42/Rac1信号通路，同时与CDK1在宫颈癌细胞内共定位调控细胞周期（G2/M期），促进宫颈癌细胞增殖。ECT2基因可能在宫颈癌靶向治疗中具有一定的临床价值。