荧光PCR法在围生期孕妇B族链球菌筛查中的应用及CAMP试验阴性B族链球菌分子特征分析

周 杰，张 莉，杨书才，张 扬，康文荣，叶丽娴，王革非

B族链球菌(group B streptococcus,GBS)是革兰阳性兼性厌氧菌，常存在于胃肠道和泌尿生殖道内，为条件致病菌[1]。围生期孕妇阴道或直肠内GBS的定植率为10%～35%[2-3]。约有50%的GBS携带孕妇会把该菌传播给新生儿，在没有产前抗菌药物预防的情况下，1%～2%的新生儿会出现早发型GBS感染，表现为重症肺炎、败血症及化脓性脑膜炎，如不及时治疗会造成新生儿死亡或神经系统后遗症等严重不良后果[4-5]。美国自20世纪90年代开始对围生期孕妇进行GBS筛查，对携带GBS的孕妇产前应用抗菌药物预防，极大降低了新生儿GBS感染率[6]。细菌培养法是GBS筛查的金标准，目前围生期孕妇阴道/直肠拭子筛查GBS的方法主要为血平板培养法、显色平板培养法。但培养法存在耗时长、灵敏度低、影响因素多等缺点。本研究拟通过比较荧光聚合酶链反应(PCR)法与显色平板培养法筛查围生期孕妇阴道/直肠拭子的阳性率，分析荧光PCR法筛查GBS的可行性。现作报道。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2020年4-12月产科门诊孕妇标本1 143份，年龄18～45岁，孕35～37周，由产科医生先用一次性棉拭子采集孕妇阴道下1/3处分泌物，再将同一拭子插入肛门内1～3 cm，旋转一圈后取出，1 h内送实验室。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 VITEK-2型全自动细菌鉴定仪及鉴定卡(法国梅里埃)，ABI7500荧光定量PCR仪(美国ABI)；GBS增菌肉汤管(江门凯琳)，GBS显色平板(郑州安图)，GBS核酸检测试剂(深圳优康)。

1.2.2 显色平板培养法 实验室接到样本后，将拭子放入GBS增菌肉汤管，于35 ℃培养箱增菌18～24 h。将增菌管内肉汤混匀，用一次性接种环取10 μL肉汤接种GBS显色平板，三区划线后将平板放入35 ℃、5% CO2培养箱。经24～48 h培养，从显色平板挑取红色或紫红色菌落转种血琼脂平板培养18～24 h，挑取菌落制备菌悬液后用细菌鉴定仪进行细菌鉴定。

1.2.3 荧光PCR法 将接种后的增菌肉汤管放4 ℃冰箱冷藏，显色平板培养为阳性的增菌肉汤管用荧光PCR法单独检测。培养为阴性的增菌肉汤管，各吸取100 μL肉汤到无菌管中，每5个增菌肉汤管组成1组样本，用荧光PCR法检测，对检测为GBS阳性的混合样本，再单独对每个增菌肉汤管进行检测。荧光PCR法具体操作步骤如下：将含有增菌液的无菌管12 000 r/min离心5 min，取沉淀加入50 μL核酸提取液，震荡后3 000 r/min 离心10 s，100 ℃孵育10 min，12 000 r/min离心5 min，上清液供PCR扩增用。阴性、阳性对照直接取50 μL，加入50 μL核酸提取液，其余操作步骤同样本。在准备好的PCR反应管中加入GBS反应液35.2 μL、Taq酶0.8 μL，然后分别加入4 μL待测样本和阴性、阳性对照处理液，盖上管盖3 000 r/min离心10 s。荧光PCR扩增程序为95 ℃ 3 min 1个循环，94 ℃ 15 s ，60 ℃ 30 s 40个循环。检测结果按照CT值≤38.0判为阳性，CT值>38.0～<40的样本重新上机，重做结果CT值<40者为阳性，否则为阴性。

1.2.4 CAMP试验 GBS通常产生CAMP因子，该因子能增强金黄色葡萄球菌的β溶血素溶解红细胞的能力，CAMP试验是指GBS和金黄色葡萄球菌的交界处溶血能力增加，出现箭矢型的透明溶血区。CAMP试验具体操作流程：用ATCC25923金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上划一条横线，GBS靠近金黄色葡萄球菌划一条竖线，然后将血琼脂平板放35 ℃温箱中培养18～24 h，观察其协同溶血现象。

1.2.5 基因检测 CAMP试验阴性的GBS菌株送上海派诺森公司进行16SrDNA菌株测序，将测序数据提交到GenBank数据库进行比对分析，并利用MEGA7.0软件对同源相近的链球菌的16SrDNA序列构建进化树。为验证这些菌株是否为编码CAMP因子的cfb基因缺失所致，参照文献[7]中报道的cfb基因设计引物，引物序列为F:5′-ATG ATG TAT CTA TCT GGA ACT CTA GTG-3′；R:5′-CGC AAT GAA GTC TTT AAT TTT TC-3′。对分离的CAMP阴性GBS、2株临床分离CAMP阳性GBS、阴性对照、阳性对照进行cfb基因检测，预期目的基因片段大小为260 bp。基因扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳，将基因扩增产物送上海派诺森公司进行测序，将测序结果提交到GenBank数据库中进行BLAST比对。

1.3 统计学方法 采用χ2检验。

2 结果

2.1 2种方法检测结果比较 GBS显色平板培养出146株GBS，阳性率为12.77%，荧光PCR法检出191例阳性标本，阳性率为16.71%，2种方法阳性率差异有统计学意义(P<0.01)；荧光PCR法与显色平板培养法相比，敏感性为93.15%、特异性为94.48%、符合率为94.31%(见表1)。显色平板培养法与荧光PCR法检测GBS阳性结果见图1。

表1 荧光PCR法与显色平板培养法检测结果比较(n)

2.2 CAMP试验结果 显色平板培养法检出146株GBS，其中10株荧光PCR法检测为阴性，将这10份GBS菌株的增菌肉汤管取出重新鉴定，均为GBS。对这10株GBS、阴性对照、阳性对照进行CAMP试验，10株GBS和阴性对照菌株为阴性，阳性对照菌株为阳性。阴性对照选用粪肠球菌ATCC29212，阳性对照选用B族链球菌ATCC13183(见图2)。

2.3 CAMP试验阴性GBS菌株基因检测结果 进化树分析结果显示，10株CAMP阴性菌株(GBS1-GBS10)与GBS(AB596948)聚为一类(见图3)。电泳结果显示，2株CAMP阳性GBS和阳性对照有特异性条带，10株CAMP阴性GBS和阴性对照未出现特异性条带。阳性对照测序结果提交到GenBank数据库中进行BLAST比对，与cfb基因符合率为100%(见图4)。 2株CAMP阳性菌株含有cfb基因，10株CAMP阴性GBS未扩增出cfb基因，证实10株GBS表现为CAMP试验阴性是由cfb基因缺失导致。

3 讨论

GBS可引起牛乳腺炎，最早为兽医界所关注。1938年首次报道3例病人死于GBS感染，证实该菌也可以感染人类。严重的围生期GBS感染最初被描述于20世纪60年代。20世纪70年代，GBS成为美国新生儿感染和死亡的主要病原菌[8]。围生期孕妇阴道/直肠携带的GBS，通过分娩时传播给新生儿，是新生儿感染GBS的主要途径。美国CDC于1996年发布了“预防围生期B族链球菌病指南”，该指南在2002年和2010年进行了更新，指南中明确指出对围生期孕妇进行阴道/直肠拭子GBS筛查，如为阳性，在产时进行抗菌药物预防，以降低新生儿感染率和死亡率[9]。20世纪90年代，美国通过基于围生期GBS筛查与产时抗菌药物使用来预防新生儿GBS感染，新生儿GBS早发型感染率从20世纪90年代初期的1.8/1 000下降到2010年的0.26/1 000[10]。

已有研究[11]显示，不同地区的孕妇GBS携带率有较大差异，非洲地区为18.1%～26.7%，美洲地区为16.7%～22.7%，欧洲地区为16.1%～22.0%，东南亚地区为6.8%～15.3%，这可能与GBS在不同人群携带率有差异和检测方法的不同有关。另一篇纳入多篇中国研究共44 716例孕妇的荟萃分析显示，中国孕妇GBS定植率为11.3%[12]，本次的显色平板培养法12.77%的阳性率与之接近，但是低于荧光PCR法16.71%的阳性率。

细菌培养法虽然是GBS筛查的金标准，但是存在耗时长、操作复杂等特点，分子生物学检测技术具有敏感度高、检测周期短等特点，目前已广泛应用于病原体检测。本次采用的荧光PCR法与显色平板培养法相比，敏感性、特异性及符合率均高于90%，是一种可以代替培养的方法。本次显色平板共分离出146株GBS，低于荧光PCR法检测出191份阳性标本，分析原因有以下两个方面，首先是显色平板培养法受方法学限制，只能取10 μL左右增菌肉汤进行培养，不然不利于单个菌落的分离，这远低于荧光PCR法用100 μL增菌肉汤进行基因扩增；其次是GBS增菌肉汤管只抑制革兰阴性杆菌，对革兰阳性球菌没有抑制作用，当标本中含有大量粪肠球菌和其他链球菌而只有少量GBS时，这些细菌通过竞争抑制GBS的增殖，从而在培养时造成漏检。

CAMP反应是指GBS特异性地增加金黄色葡萄球菌对绵羊红细胞的溶解能力[13]。因CAMP反应具有很高的特异性，很久以来人们一直将是否出现CAMP现象作为实验室诊断GBS的一个重要依据[14]。以往文献[15-16]报道，绝大多数GBS含有编码CAMP因子的cfb基因，因此许多实验室和公司将cfb基因作为靶点设计引物，通过分子生物学技术检测围生期孕妇阴道/直肠拭子中GBS，本次荧光PCR法检测试剂也选用cfb基因设计引物。 CAMP试验虽然是GBS的重要鉴别试验，但CAMP阴性的GBS偶尔也有报道，目前认为小于2%的GBS表现为CAMP阴性[17]。本次培养法分离的146株GBS中有10株为CAMP阴性，检出率为6.8%，并且这些菌株是编码CAMP因子的cfb基因缺失导致。GBS编码CAMP因子的cfb基因较高比例的缺失，说明本地区不宜采用cfb基因作为靶点设计引物检测围生期孕妇GBS，也不宜将CAMP试验作为鉴定GBS的特异性试验。

CAMP是一种重要的致病因子，在活体动物试验中发现纯化的CAMP因子可导致兔及小鼠死亡[18]。但HENSLER等[19]通过对cfb 基因进行等位基因替换后的体外及体内试验研究认为，CAMP因子在GBS的毒力系统中不是必须的。因此，CAMP因子在感染过程中的作用还存在争议。

综上，荧光PCR法和显色平板培养法相比，可有效提高围生期孕妇GBS筛查的阳性率，有条件的实验室应推广普及。本地区CAMP试验阴性GBS占比较高，应避免将该试验作为GBS的鉴别试验。因存在缺失cfb基因GBS，GBS分子检测试剂不应选择该段基因设计引物。