伊曲茶碱溶析结晶工艺

刘超， 张容容， 刘婷， 杨驷承， 刘建芳

(武汉轻工大学生命科学与技术学院， 武汉 430023)

结晶技术在工业生产及科研中有着广泛的应用，是制药工艺中一个至关重要的环节，主要涉及固体药物的分离和纯化[1-3]。与液体药物的制备过程相比，结晶工艺的设计和控制是复杂的，也是极其重要的。它不仅能够提高药物的收率和纯度，还控制着药物的固体形式(晶体粒度、粒度分布、晶型等)，这对药品的加工、稳定性和性能有着深远的影响[4-5]。目前制药工艺中，溶液状态结晶是最普遍的，但溶液状态结晶的控制结果仍然具有挑战性。结晶速率和结果取决于药物的固有结晶趋势、结晶参数等多种因素[6]。1996年美国食品药品监督管理局颁布了关于药物使用过程中的规章制度，要求生产厂家必须提供有关药物晶型、溶解度、颜色、纯度、颗粒尺寸等数据[7]。至此，药物结晶技术引起了国内外学者广泛关注，并开展了大量相关的研究工作。Sharma等[8]探索了难溶性药物替米沙坦在溶析结晶中的粒径和形态的工艺参数。经过工艺优化，最终晶体尺寸控制在320 nm，使其溶解性和生物利用度显著提升。赵改菊等[9]采取真空降温结晶的方式，考察了真空度、搅拌速率等因素对葡萄糖酸钙结晶的影响，优化工艺后生产的产品的纯度及品级均得到显著的提高，对工业生产具有指导意义。王崔岩等[10]将陶瓷膜技术应用于两性霉素B的结晶工艺中，降低了结晶的难度，并且去除了大量杂质，获得了高质量的两性霉素B，为工业生产高品质两性霉素B提供了参考依据。

伊曲茶碱是全球首个上市的腺苷A2A受体抑制剂，主要用于帕金森病的治疗，可明显改善因长期服用多巴胺受体药物导致的运动并发症，对神经系统也有一定的保护作用，因其良好的治疗效果而受到医学界的广泛关注[11]。药物的纯度、颗粒尺寸、溶解性、生物利用度等数据是药物注册申请时的基础数据。Kuroda等[12]采用混合研磨的方式制得了主粒径不足50 μm的伊曲茶碱晶体，使伊曲茶碱的分散性、溶解性、生物利用度显著提高。目前国内外关于伊曲茶碱结晶工艺并没有详细文献记载。现根据伊曲茶碱易溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)且难溶于水的特性，以DMF为溶剂，水为溶析剂，采取溶析结晶的方式，探究结晶过程中有关的影响因素。最终经过优化结晶工艺参数，获得主粒径为12.6 μm、粒度分布均匀的伊曲茶碱晶体产物，为工业上制备高质量的伊曲茶碱产品提供基础依据和参考。

1 实验

1.1 实验试剂及仪器

伊曲茶碱，质量分数≥98%，湖北惠择普医药科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，AR，体积分数99%，天津市大茂化学试剂厂；无水乙醇，AR，体积分数99%，国药集团化学试剂有限公司。

夹套结晶器，盐城垒固科技有限公司；高精度水银温度计，衡水创纪仪器仪表有限公司；低温恒温槽(DHC-1005-A)，杭州齐威仪器有限公司；磁力搅拌器(SCL-RTC+)，杭州齐威仪器有限公司；微量柱塞泵(DP-0502)，北京亚欧德鹏科技有限公司；激光粒度仪(Mastersizer 3000)，英国马尔文仪器有限公司；扫描电子显微镜(JSM-6510LV)，日本电子株式会社。

1.2 实验装置及实验步骤

1.2.1 实验装置

本次试验的结晶装置如图1所示。

图1 伊曲茶碱结晶工艺装置Fig.1 Experimental device for dilution crystallization of istradefylline

1.2.2 实验步骤

(1)配制一定浓度伊曲茶碱-DMF溶液，加入结晶器中，搅拌溶解。

(2)将养晶温度设置为20 ℃，待温度恒定时，用柱塞泵以2 mL/min速率滴加溶析剂(去离子水)。

(3)滴加完毕，静置60 min，将结晶母液抽滤，滤饼用无水乙醇淋洗，放入烘箱中，60 ℃真空干燥5 h，称重，密封保存。

(4)改变结晶条件，重复以上实验步骤。

1.3 结晶产物评价标准

1.3.1 产物收率(Y)

根据结晶前伊曲茶碱质量M1与结晶析出质量M2计算，公式为Y=M2/M1。

1.3.2 平均粒径(MS)和变异系数(CV)

平均粒径(MS)是指样品的累积分布分数达到50%所对应的粒径即D50；变异系数CV=(D90-D10)/D50；D10和D90分别表示样品的累积分布分数达到10%和90%所对应的粒径，反映粒度分布宽度[13]。变异系数越小，表明晶体粒度分布越集中，反之则表明晶体粒度分布范围广。

2 结果与讨论

2.1 结晶液初始浓度对伊曲茶碱结晶影响

2.1.1 初始浓度对产品收率的影响

根据伊曲茶碱在水+DMF二元混合体系中热力学性质，结晶液初始浓度越高，理论上结晶收率也越高。从图2(a)的实验数据可知，实验结果符合这一规律。相同结晶条件下，随着伊曲茶碱浓度增加，晶体析出量逐渐增加，当初始浓度≥12 mg/mL时，收率增长缓慢。

2.1.2 初始浓度对伊曲茶碱晶体粒度及其分布的影响

浓度对结晶结果的影响与溶液的过饱和度有着紧密的联系[14]。从图2(b)、图2(d)可以发现，初始浓度较低时，晶体主粒度较小且粒度分布集中，随着浓度的增加，平均粒径呈增大趋势，粒度分布变宽。这种现象可以从成核速率与结晶液浓度间的依赖关系来解释[15]。在较高的浓度下，成核速率增加，导致大量的晶核形成，促进晶体生长和凝聚。同时高浓度会加快晶体间碰撞的频率，引发团聚，诱导大颗粒的形成。此外，大量的晶核增加了溶液黏度，阻碍了药物的扩散，导致界面处不均匀的过饱和度，增大了粒径。由图2(c)可以看出，当初始浓度为12 mg/mL时，此时的变异系数最小，而变异系数越小，则表明晶体的粒度分布更集中。图3显示了不同初始浓度重结晶晶体的扫描电镜图像。电镜图像表明，在高浓度下，晶体出现明显的团聚现象。综上分析可知，初始浓度对于结晶产物的收率、粒度分布、晶体形貌有着重要的影响，结晶工艺最佳浓度应控制在12 mg/mL。

图2 初始浓度对伊曲茶碱结晶的影响Fig.2 Effect of initial concentration on the crystallization of istradefylline

图3 不同初始浓度时获得伊曲茶碱晶体SEM图像Fig.3 SEM images of istradefylline crystals obtained at different initial concentrations

2.2 溶剂与溶析剂(水)体积分数比对伊曲茶碱结晶影响

2.2.1 水的加入量对产品收率的影响

图4 溶剂与溶析剂体积分数对伊曲茶碱结晶的影响Fig.4 Effect of the volume ratio of solution to anti-solvent on the crystallization of istradefylline

由图4(a)可知随着水的加入量逐渐增大，伊曲茶碱收率逐渐升高，当体积分数比例≥1∶3时，产品析出量增加缓慢，继续增加水量，收率提升受阻且浪费溶剂，因此溶剂和溶析剂的比例应控制在1∶3。

2.2.2 溶析剂的量对伊曲茶碱晶体粒度及其分布的影响

从图4(b)观察到，晶体的平均粒径与溶析剂的体积呈反比，随着体积比的增加，晶体的主粒度逐渐减小。结晶包括成核和晶体生长两个主要步骤。与晶体生长速率相比，成核速率更依赖于过饱和度[16]。大量的溶析剂迅速增加了溶液过饱和度，提高了成核速率诱导大量细小晶核生成。相比之下，溶析剂体积较低时，由于伊曲茶碱在DMF-水中有着较好的溶解度，导致过饱和度较低，晶核形成较少，致使晶体主粒径偏大。从图4(c)、从图4(d)中可以观察到，当溶剂与溶析剂的体积分数比为1∶3时，此时的变异系数最小，粒度均一性较好。图5显示了不同体积溶析剂的重结晶伊曲茶碱扫描电镜图像。电镜图像证实了溶剂与溶析剂体积比为1∶3，晶体在尺寸和形状上更均匀。

2.3 溶析剂滴加速率对伊曲茶碱结晶的影响

2.3.1 滴加速率对产品收率的影响

由图6(a)可知，随着溶析剂滴加速率的增加，伊曲茶碱收率呈先升高后降低的趋势。是因为当滴加速率过低时，结晶液体系过饱和度偏低，晶体析出动力不足，且耗费时间，当滴加速率过高时，溶液体系过饱和度偏高，致使大量晶核产生，诱导大量细晶析出，在处理过程中易损失。

图5 不同比例溶析剂时获得伊曲茶碱晶体SEM图像Fig.5 SEM images of istradefylline crystals obtained with different proportions of anti-solvent

图6 滴加速率对伊曲茶碱结晶的影响Fig.6 Effect ofdripping speed on the crystallization of istradefylline

2.3.2 滴加速率对伊曲茶碱晶体粒度及其分布的影响

滴加速率对结晶过程的影响，取决于药物溶液和溶析剂之间的过饱和程度和质量传递[17]。从图6(b)观察到，随着滴加速率的提高，伊曲茶碱平均粒度呈逐渐降低的趋势。从实验结果可以发现，滴加速率对晶体粒径的影响是显著的，较快的滴加速率加速了传质过程和过饱和度，从而导致较高的成核速率以产生较小的晶体。Zhou等[18]研究表明，溶析剂的加入会增加晶体表面积，从而加快结晶过程。而在较低的滴加速率下，最初生成的晶核获得了更多的晶体生长时间，因此导致了大晶体的形成。从图6(c)、从图6(d)中可以发现，当滴加速率为2 mL/min时，此时的变异系数最小，粒度分散程度更均匀。图7显示了在不同滴加速率下获得的再结晶药物晶体的扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)图像，形态清楚，晶体呈短针状，当滴加速率为2 mL/min时，晶体品质最佳。

图7 不同滴加速率时获得伊曲茶碱晶体SEM图像Fig.7 SEM images of istradefylline crystals obtained at different dripping speed

2.4 结晶温度对伊曲茶碱结晶影响

2.4.1 结晶温度对产品收率的影响

图8 结晶温度对伊曲茶碱结晶的影响Fig.8 Effect of crystallization temperature on the crystallization of istradefylline

由图8(a)数据可知，随着温度的升高，结晶收率呈逐渐降低趋势，温度在15～20 ℃范围内，下降趋势平缓。且结晶温度过高，会促使溶液中分子运动和碰撞频率加快，从而诱导微小晶体的生成，在过滤、洗涤等操作过程中易损失。

2.4.2 结晶温度对伊曲茶碱晶体粒径的影响

温度是结晶过程中的一个关键因素，因为它可以通过改变亚稳态和稳态的溶解度之比来改变过饱和度，从而产生不同的结晶结果[19]。从图8(b)可以发现，当养晶温度为20 ℃时，伊曲茶碱晶体粒径较大，粒度分布均匀。根据经典成核理论，成核速率与温度成反比[8]。随着温度的降低，结晶液成核速率逐渐增加，过饱和度逐渐变大，诱导大量晶核产生，从而导致晶体平均粒度较小。随着结晶温度升高，成核速率降低，而晶体有着充足的生长动力致使晶体主粒度偏大。同时温度也影响药物在溶剂中的平衡溶解度，较高的温度增加了药物的溶解度，导致溶液中晶体延迟沉淀，以及较少的晶核产生，随后促进晶体生长，从而形成更大的颗粒[14,20]。但温度过高，会导致结晶液过饱和度偏低，介稳区宽度变窄，晶体生长动力不足，不利于晶体的生长，晶体主粒度减小。从图8(c)、图8(d)中可以发现，当结晶温度为20 ℃时，此时的变异系数最小，粒度一致性表现较好。图9显示了在不同温度下获得的再结晶药物晶体的SEM图像，可以观察到粒度大小及粒度分散程度，当温度为20 ℃时，粒径及分散程度均较好。

2.5 陈化时间对伊曲茶碱结晶影响

2.5.1 陈化时间对产品收率的影响

陈化时间即养晶过程中静置时间，该过程主要为小晶体的溶解以及大晶体的生长，延长陈化时间也是工业中增加收率及增大粒径的常用方式。从图10(a)发现，随着陈化时间的增加，伊曲茶碱结晶收率逐渐增加，当陈化时间≥90 min时，收率增长趋于水平。

图9 不同结晶温度时获得伊曲茶碱晶体SEM图像Fig.9 SEM images of istradefylline crystals obtained at different crystallization temperatures

图10 陈化时间对伊曲茶碱结晶的影响Fig.10 Effect of the aging time on the crystallization of istradefylline

图11 不同陈化时间时获得伊曲茶碱晶体SEM图像Fig.11 SEM images of istradefylline crystals obtained at different aging times

2.5.2 陈化时间对伊曲茶碱晶体粒径的影响

从图10(b)可知，晶体平均粒径与陈化时间成正比。陈化时间在30～90 min范围内，伊曲茶碱晶体主粒径增长不明显，但养晶时间超过90 min后，晶体粒径增大趋势明显。这是因为陈化时间较短，晶核与晶体不能得到充分的生长，导致晶体主粒径小、粒度分布不均匀。适当的延长陈化时间，有利于晶体的生长，得到的晶体粒度分布较为均匀。但如果陈化时间过长，晶体已获得充分生长，此时的大颗粒晶体易出现破碎，导致二次结晶，晶体的粒度均一性也会变差[21]。此外，延长陈化时间增加了结晶周期，耗能又耗时。从图10(c)、从图10(d)中可以观察到，当陈化时间为60 min时，此时的变异系数最小，粒度分布更均匀。图11显示了不同陈化时间下获得的再结晶药物晶体的SEM图像，可以观察到陈化时间为60 min时，结晶产品的晶体粒径较大，粒度一致性表现较好。

3 结论

通过大量的实验，探究了各种因素对伊曲茶碱晶体收率、主粒度及粒度分布的影响。研究表明，随着结晶液初始浓度的增加，伊曲茶碱的收率先逐渐增加后趋于平缓，粒度增大，当初始浓度为12 mg/mL时，粒度分布较集中；随着溶剂与溶析剂体积分数比的增大，收率增大，粒度减小，当体积比为1∶3时，粒度均一性较好；随着溶析剂滴加速率的加快，收率呈先增加后降低的趋势，粒度减小，当滴加速率为2 mL/min时，粒度分布较窄；随着养晶温度的增加，收率逐渐降低，粒度先增大后减小，当养晶温度为20 ℃时，粒度一致性表现较好；随着陈化时间的增加，收率和粒度逐渐增大，当陈化时间为60 min时，粒度分布较均匀。综合分析以上影响因素，得到伊曲茶碱较佳结晶方案，为工业上制备高质量的伊曲茶碱产品提供基础依据和参考。