两种佐剂对细鳞鲑杀鲑气单胞菌灭活疫苗免疫效果的影响

文/何亚鹏

为了探究添加弗氏佐剂和蜂胶佐剂后杀鲑气单胞菌灭活疫苗的免疫效果，分别制备含两种不同佐剂的杀鲑气单胞菌灭活疫苗，免疫细鳞鲑，并设不加佐剂组和对照组，分别于免疫后不同时间采血，检测血清抗体效价，评价相关免疫指标和免疫保护率，以期为鲑鳟鱼疥疮病的防控和珍稀水生物种保护提供技术参考。

杀鲑气单胞菌属于气单胞菌属的革兰氏阴性短杆菌，其在淡水与海水环境中广泛存在，该菌主要引起16种鲑鳟鱼类如大马哈鱼、细鳞鲑、大西洋鲑、虹鳟和河鳟等疖疮病及溃疡病，导致幼鱼死亡率高，其宿主范围也在不断扩大，有引起鲤科鱼类溃疡病和红皮炎的报道。如果任其流行，不仅会进一步威胁珍稀鲑鳟鱼物种的生存，影响救护和繁育工作，还有可能危害我国水产养殖业的健康发展。

为此，本文探究了添加弗氏佐剂和蜂胶佐剂后杀鲑气单胞菌灭活疫苗的免疫效果，并总结成文。

一、材料与方法

（一）实验鱼

为本中心驯养车间内养殖的同一批次均一细鳞鲑，体长平均为13cm，体重平均14g，鱼外观及活动均正常，按习性在14℃左右水温正常养殖。

（二）菌种来源

杀鲑气单胞菌由北京市水生野生动植物救护中心分离鉴定并保存。

（三）灭活疫苗的制备

杀鲑气单胞菌由-80℃冰箱取出，接种于TSB肉汤培养基活化培养两代，检查染色特征及菌体形态，显示正常后在TSB肉汤培养基中培养18h，加入终浓度为0.3%的甲醛，混匀，恒温培养箱37℃放置48h灭活细菌。离心取沉淀的菌体，用无菌生理盐水反复洗涤菌体3次，去除残留的培养基和甲醛，最后悬浮于无菌生理盐水中，接种培养基培养检测，确认无活菌后，即制得杀鲑气单胞菌全菌灭活疫苗。采用麦氏比浊法调整菌浓度为2.0×10CFU/mL，分别加入弗氏佐剂和蜂胶佐剂，混匀，完毕后置于4℃冰箱保存备用。

（四）免疫注射和样品采集

取弗氏佐剂灭活疫苗、蜂胶佐剂灭活疫苗、不加佐剂灭活疫苗和生理盐水（对照组），分别采用腹腔注射方式免疫细鳞鲑，每尾0.1mL，分别于第1d和注射后第7d、14d、21d、28d、和35d采血。每组随机取10尾采血，收集血清。

（五）抗体效价等免疫指标测定

抗体效价测定：采用传统的试管凝集法检测血清抗体水平，观察细菌的凝集程度，取每组平均值作为结果。

溶菌酶（Lysozyme，LZM）是血清中决定吞噬细胞能否杀灭所吞噬的致病菌一种水解酶，酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）和巨噬细胞溶酶体活力相关，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）作为抗氧化酶可清除体内自由基，SOD活力的变化能够表明机体对外来物质的清除力，它们和动物机体的免疫力密切相关，检测其变化有利于了解免疫后机体抗病力的变化水平。本试验选用检测试剂盒，按照操作测定计算各组血清样品平均的溶菌酶、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶活力。

（六）免疫保护率测定和临床应用

将四组生长状况一致的鱼苗分别注射两种灭活疫苗、不加佐剂灭活疫苗和生理盐水，28d后，各组鱼随机取30尾攻毒，腹腔注射0.1mL杀鲑气单胞菌活菌液（1.0×10CFU/mL），观察死亡情况，计算免疫保护率。免疫保护率=［1-（免疫组死亡率/对照组死亡率）］×100%。

将制备的疫苗在中心养殖车间（试验点1）和玉渡山养殖基地（试验点2）进行应用，各试验点分为弗氏佐剂免疫组、蜂胶佐剂免疫组和对照组，每尾0.1mL，注射后均正常养殖，2个月后统计各组存活率。

二、结果

（一）抗体效价等免疫指标检测结果

采用传统的试管凝集法，测得试验组的平均抗体效价呈上升趋势，弗氏佐剂组和蜂胶佐剂组均在第1d～28d快速上升，第28d达到峰值，分别为1:460.8、1:508.5，随后缓慢下降；不加佐剂组在第21d达到峰值1:281.6，随后缓慢下降；对照组无明显变化（见表1）。

表1 各组鱼血清凝集抗体效价的检测结果

血清中免疫相关的三种酶活力检测结果见表2，两种灭活疫苗免疫后，免疫组血清溶菌酶、酸性磷酸酶活力和超氧化物歧化酶活力于免疫后明显上升，高于不加佐剂组，蜂胶佐剂组优于弗氏佐剂组，随后活力逐渐下降，但一直保持在高于对照组的水平，对照组各时间点的指标变化不显著。

表2 各组鱼LZM、ACP和SOD活力检测结果

（二）免疫保护率测定

攻毒试验记录的四组死亡数如图1。攻毒10d后，弗氏佐剂组、蜂胶佐剂组、不加佐剂组的死亡率分别为13.3%、10%、20%，明显低于对照组的76.7%，蜂胶佐剂组最低；弗氏佐剂组、蜂胶佐剂、不加佐剂组的相对免疫保护率分别为82.7%、87.0%、73.9%（见表3）。

表3 活菌攻毒后各组的死亡率和免疫保护力

图1 活菌攻毒后各组的累计死亡数

（三）临床应用效果

将制备的疫苗于试验点的细鳞鲑鱼苗中应用，分弗氏佐剂免疫、蜂胶佐剂免疫组和对照组，免疫后均正常养殖，2个月后统计各组存活数，结果显示与对照组相比，在试验点1应用疫苗后可提高存活率10%以上，试验点2可提高存活率16%以上，可以减少该病造成的损失（见表4）。

表4 临床应用结果

三、讨论

杀鲑气单胞菌广泛存在于水体环境中，该病原引起的疥疮病和溃疡病每年都会造成相关水生生物损失严重，对冷水鱼养殖行业和珍稀水生动物保护有较大的威胁。

鱼类疫苗发展较畜禽疫苗晚，在生产中应用较多的仍是灭活疫苗。本研究以杀鲑气单胞菌为研究对象，制备不同佐剂的杀鲑气单胞菌全菌灭活疫苗，弗氏佐剂组、蜂胶佐剂组和不加佐剂组血清平均抗体效价于免疫后呈上升趋势，蜂胶佐剂组的抗体效价更高。随后进行免疫保护实验，结果表明弗氏佐剂全菌灭活疫苗保护效果可达到82.7%，蜂胶佐剂全菌灭活疫苗保护效果可达到87.0%，加入佐剂后的疫苗产生更强更持久的免疫力，蜂胶佐剂全菌灭活疫苗更优。将制备的疫苗于试验点的细鳞鲑鱼苗中应用，均可以提高其存活率，降低损失，蜂胶佐剂效果更好。本实验比较了两种佐剂的免疫效果，有助于相关疫苗的进一步研发和应用。