以程序性坏死为靶点的动脉粥样硬化研究进展

迟俊鹏 蒋峻宇 廖俊进 刘涵睿 赵辉

安徽理工大学医学院，安徽淮南 232001

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种累及动脉壁损伤并形成纤维脂肪斑块的一种病变，近年来发病率逐年增多且呈日趋年轻化。冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌梗死、卒中等为引起动脉粥样硬化患者死亡的主要原因。细胞程序性坏死是一种受精密调控的非凋亡性细胞死亡方式，其参与了炎症性反应、心血管系统疾病、神经系统疾病及肿瘤等多种疾病的发生。细胞程序性坏死受细胞自噬、蛋白质转换等多因素共同调节。有研究证实，在动脉粥样硬化的发生和发展过程中，细胞程序性坏死也发挥了重要的调节作用。因此，深入了解程序性坏死在动脉粥样硬化中的作用和分子调节机制，有望为动脉粥样硬化提供有效的临床治疗靶点。

1 程序性坏死

细胞死亡的三大经典类型：凋亡、自噬和坏死。细胞的凋亡和自噬是高度调控的细胞死亡过程，坏死是一种不受控制的细胞死亡。细胞程序性坏死，通常也被称作“坏死性凋亡”，是有别于传统坏死的可调控的一种新的细胞死亡方式。

坏死是一种细胞死亡形式，其通常的特征是组织、细胞的自溶性变化，涉及多种促炎因子和化合物蛋白的上调。而程序性坏死一旦发生，坏死细胞将迅速丧失胞质膜的完整性并释放胞内的促炎因子，引起显著的炎症反应，表现为大量的炎性细胞浸润和激活。程序性坏死的发生是由受体相互作用蛋白激酶1（receptor interacting protein kinase 1，RIPK1）和受体相互作用蛋白激酶3（receptor interacting protein kinase 3，RIPK3）介导的细胞死亡，混合系列蛋白激酶样结构域（mixed lineage kinase domain like protein，MLKL）作为其执行分子导致胞膜裂解，执行程序性坏死。

程序性坏死可以分成三类：由肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）引起的外始式程序性坏死；由缺血诱导的内始式程序性坏死；以及由活性氧类引起的内始式程序性坏死。目前研究表明，凋亡由内源性的线粒体参与启动，而程序性坏死不需要线粒体参与，也不依赖于含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）的活化和随后的级联反应，其调控有自己特有的机制和体系。另外，程序性坏死也可以通过释放损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）来启动炎症反应，尽管早期程序性坏死的发生是用来保护细胞或组织免受病原体的入侵，但是晚期发生的氧化应激和细胞衰老，进而促发的慢性炎症等都将对机体产生不利的信号。

2 程序性坏死分子调控机制

程序性坏死的分子调控机制十分复杂多样，它与细胞的坏死和凋亡有着密切的联系和区别。目前已知的较经典的调控机制是TNF-α 介导的程序性坏死，即TNF-α-RIP1/3-MLKL 通路。TNF-α 是一种重要的促炎因子，与细胞膜上的受体TNFR 结合，受体招募TRDD、RIPK1 等形成复合体Ⅰ，接着复合体Ⅰ脱离TNFR，由RIPK1、RIPK3、FADD、TRADD、caspase-8形成复合体Ⅱ，如果caspase-8 失活，则RIPK1 和RIPK3 将能够相互磷酸化，从而成为坏死小体。RIPK1 和RIPK3 磷酸化后获得激酶活性，将MLKL磷酸化，使其获得活性进行调控。Hu等通过建立大鼠心肌缺血/再灌注模型和缺氧/复氧损伤细胞模型并研究发现白藜芦醇抑制H9c2 细胞的坏死，可能是通过抑制TNF-α-RIP1/3-MLKL 信号通路，进一步保护心肌细胞免受缺氧/复氧导致的损伤。

而当病原体（病毒）释放核酸进入细胞内，就会激活内源性的程序性坏死通路。Z-DNA 结合蛋白1（Z-DNA binding protein 1,ZBP1）能够识别并结合细胞质中的双链DNA 分子，同时激活RIPK3，使其磷酸化，获得激酶活性。激活的RIPK3 磷酸化MLKL，诱导细胞程序性坏死。该通路不需要RIPK1 的参与，TOLL 样受体3（toll-like receptor，TLR3）能够识别并结合细胞质中的双链RNA 分子，并通过结合的TOLL样受体衔接分子招募并磷酸化RIPK1 和RIPK3，从而促进坏死小体的生成，诱发程序性坏死。

3 动脉粥样硬化中的程序性坏死

动脉粥样硬化是一种发生在大中动脉管壁上的慢性炎症反应性疾病，是心血管系统疾病中最常见的疾病。动脉粥样硬化发展至晚期，不稳定斑块破裂导致的急性血栓和心肌梗死是严重威胁人类健康的主要原因。

垂体腺苷酸环化酶激活多肽（pituitary adenylate cyclase activating polypeptide，PACAP）是一种具有血管活性和细胞保护作用的神经肽，其主要通过PAC1受体信号转导来发挥作用，于是有学者利用PAC1（-/-）小鼠测定动脉粥样硬化斑块中的程序性坏死和炎症反应，发现程序性坏死的标志物和免疫反应信号有所增加，表明在动脉粥样硬化的小鼠中的确有细胞程序性坏死的发生。已经有研究表明：参与程序性坏死的RIPK1、RIPK3 和MLKL 在动脉粥样硬化形成中具有重要作用。Zhao等和Colijn等的研究表明，敲除RIPK3 并诱导小鼠动脉粥样硬化，能够增强动脉粥样硬化小鼠斑块的稳定性，甚至在发生动脉粥样硬化的主动脉处几乎检测不到程序性坏死的标记物，也表明RIPK3 参与的程序性坏死在动脉粥样硬化中起着关键性作用。

然而，也有研究表明，程序性坏死在动脉粥样硬化疾病的进展过程中起到加速作用，程序性坏死可以促进炎症反应和动脉粥样硬化的发展。有学者发现氧化低密度脂蛋白能够上调巨噬细胞中RIPK3等相关基因的表达，同时，能导致巨噬细胞程序性坏死，引发炎症，加速动脉粥样硬化的发展。在动脉粥样硬化疾病的发展过程中，一些炎症因子如白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、TNF-α和一些单核细胞、多核细胞在病变中的积累都能够引起促炎反应，加剧炎症在动脉粥样硬化中的发展，而程序性坏死又导致泡沫细胞死亡，更加加速了动脉粥样硬化的进展。

值得注意的是，作为程序性坏死执行者的MLKL，在动脉粥样硬化斑块的形成过程中发挥着至关重要的作用，但其磷酸化也决定着细胞坏死的路径。目前最新的研究表明：如果只敲除或低表达MLKL，将导致脂质运输缺陷，从而导致巨噬细胞中脂质沉积。低表达MLKL 能减少动脉粥样硬化的坏死核心，却增加了巨噬细胞的脂质沉积。Zhao等通过镉暴露增加MLKL 基因的表达，证明了FPR2/ TGF-β/NF-κB 通路能够引起猪心肌坏死，也表明动脉粥样硬化中程序性坏死的执行分子MLKL 也在细胞坏死中发挥着重要作用。

4 以程序性坏死为靶点的AS 治疗

在过去的几十年里，动脉粥样硬化的治疗主要集中在降脂层面，主要是通过使用他汀类药物来实现，然而此类药物需长期服用，且对部分患者疗效不佳，不能有效延缓动脉粥样硬化的进程。

近年来随着对程序性坏死的深入研究，研究发现了一些能特异性抑制程序性坏死相关靶点蛋白的小分子物质，使人为地调控程序性坏死的发生和发展成为可能。其中最先发现的是特异性的小分子抑制剂（necrostatin-1，Nec-1），后来通过研究陆续出现了necrostatins 家族的Nec-3、Nec-5 和GSK963等特异性药物，这些药物能够强效地、选择性作用于RIPK1，从而实现抑制动脉粥样硬化发展过程中的程序性坏死。以Nec-1 为例，通过抑制RIPK1 的活性，进而抑制了RIPK1-RIPK3 复合体的形成，阻断了下游的程序性坏死。此外有最新的研究采用Nec-1 类似物（Z）-5-（3,5-dimethoxybenzyl）-2-imine-1-methylimidazolin-4-1（DIMO）通过其自噬途径来抑制程序性坏死，结果发现DIMO 能够减少心肌细胞的死亡、抑制RIPK1 的表达，具有心血管方面的保护作用。因此，本研究认为，necrostatins家族的药物及其类似物将来会成为研究程序性坏死抑制剂的新热点。

目前RIPK1 抑制剂已被成功应用于动脉粥样硬化小鼠模型，以抑制程序性坏死，其不仅可以抑制动脉粥样硬化的发生还能调控粥样斑块的稳定性。因此，靶向抑制程序性坏死可能是一种新的治疗干预策略。最新研究结果表明，TLR4/NFκB p65 通路抑制剂Klotho 蛋白，可以减轻血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞的程序性坏死，提示Klotho 蛋白也可能是一种潜在的程序性坏死的抑制剂。Sohrabi等在RIPK1 缺陷样本中发现单核细胞对血管内皮细胞的黏附能力显著降低，还发现RIPK1 敲除的小鼠的动脉粥样硬化病变程度明显下降，因此该团队也认为靶向抑制RIPK1 能够延缓慢性代谢性疾病的进展，可能具有一定的治疗作用。

但需要认识到，程序性坏死是由多种分子机制共同参与调节的复杂过程，因此单一作用的抑制剂可能达不到最佳治疗效果。而且一些程序性坏死的发生常可以不依赖于RIPK1，因此其下游的RIPK3和MLKL 也可能是动脉粥样硬化程序性坏死的潜在治疗靶点。当前，已经有学者设计出了RIPK3 的Ⅱ型DFG-out 抑制剂，也有学者分析比较了MLKL 抑制剂NSA 与化合物TC13172 的疗效差异，为靶向MLKL 的药物也提供了新思路。

综上所述，他汀类药物和程序性坏死抑制剂联合治疗，或利用RIPK1、RIPK3 和MLKL 等靶点进行单一或联合多靶点的药物开发和研究，将成为进一步推动动脉粥样硬化治疗进展的新方向。

5 小结与展望

动脉粥样硬化发生、发展的全过程，有多种不同的细胞死亡方式参与，其中细胞凋亡和程序性坏死是破坏病变部位血管、导致易损斑块形成最重要的影响因素。近年来的多项实验研究证明，在动脉粥样硬化斑块形成过程中，程序性坏死被显著激活，从而导致斑块内RIPK3 和MLKL 的mRNA 表达量显著增加，因此，近年来，随着研究的进一步深入，程序性坏死与动脉粥样硬化之间的联系更加紧密，程序性坏死在动脉粥样硬化进程中发挥的作用逐渐明晰，但相关机制仍需大量研究进一步明确。

当前，调节程序性坏死的信号通路的相关研究已经取得了很大的进展，为对治疗心脑血管疾病指明了新的方向。抑制动脉粥样斑块内细胞的程序性坏死，阻断其信号通路很可能成为未来治疗动脉粥样硬化的一个新热点。靶向抑制RIPK3 和MLKL 可能是一种新的治疗策略，为相关药物的开发和研制提供新的思路。在他汀类药物治疗的基础上加用程序性坏死的抑制剂可能是心血管疾病预防和治疗的前沿性用药策略。

需要明确的是，程序性坏死抑制剂不能阻断动脉粥样硬化斑块中所有介导坏死的信号通路，对程序性坏死的相关靶点，如RIPK1、RIPK3 和MLKL之间的关系仍需进一步深入研究。因此，开发安全有效的抑制剂将成为未来对动脉粥样硬化治疗的研究重点。