SRXN1在老年结直肠癌中的功能分析及其相互作用蛋白的初步研究

朱峰，张艳梅，赵虎，王诗雯

复旦大学附属华东医院检验科，上海 200040

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是严重危害人类健康的消化系统恶性肿瘤，我国老年CRC 发病率和病死率逐年上升［1］。近年来，尽管针对老年CRC 患者的诊断和治疗方面取得了一些进展，但大多数CRC 患者预后仍较差［2］，因此，急需筛选新的分子靶标并阐明其功能，为老年CRC 患者的治疗提供新的策略。氧化应激（Oxidative stress）可诱发糖尿病、心血管疾病、癌症等多种老年疾病，并已被证明与老年CRC 的发生密切相关［3-4］。研究发现，氧化应激可诱发慢性炎症性肠病如克罗恩病和溃疡性结肠炎，进而引发CRC［3］。SRXN1（Sulfiredoxin1）是一种抗氧化蛋白，在多种恶性肿瘤中具有促进肿瘤生长和转移的功能［5］，但其在CRC 中的作用机制尚未阐明。因此，本文通过分析SRXN1 在老年CRC 中的表达情况及与肿瘤信号通路的相关性，并筛选SRXN1 相互作用蛋白，为进一步研究SRXN1 在老年CRC 中的功能提供参考。

1 材料与方法

1．1 细胞培养CRC 细胞系SW480 购自武汉普诺赛生物公司。细胞培养于含10%胎牛血清DMEM 培养基（源培）中，于37 ℃，5%CO2条件下培养。

1．2 免疫共沉淀将SW480 细胞于10 cm 培养皿中培养24 h，使用蛋白酶体抑制剂MG132（MCE）处理4～6 h，使用细胞裂解液（碧云天，P0013）裂解细胞，收集于1.5 mL EP 管中，4 ℃裂解30 min。裂解后的细胞悬液置于4 ℃离心机中，13 000 rpm 离心15 min，吸取80 μL 上清加入20 μL 5 ×loading buffer（雅酶，LT101）作为INPUT 组。将剩余上清均分至两个新的1.5 mL EP 管，分别加入2 μg IgG（Rabbit，CST，2729S）与SRXN1（Mouse，Santa Cruz，sc-514940）抗体，置于4℃摇床孵育过夜，分别作为IgG 组与IP 组。孵育后分别加入35 μLProtein A/G PLUS-Agarose（Santa Cruz，sc-2003），4 ℃孵育2 h，用细胞裂解液漂洗4 次，2 000 rpm 离心2min。弃上清，每管加入50 μL 2 ×loading buffer，100℃变性10 min。

1．3 Western blotting将样本于100℃金属浴中预煮2 min，12 000rpm 离心2 min。使用12.5%浓度的SDS-PAGE 预制胶（雅酶，PG113）进行Western blotting 实验。将10 μg 制备好的IP 样本，于浓缩胶中80 V、分离胶中120 V 进行蛋白电泳。电泳完成后使用0.25 μm NC 膜（Milipore）转膜，恒流300 mA，75 min。转膜完成后，用5%脱脂牛奶室温摇床封闭1 h，然后用0.1%TBST 润洗NC 膜3 次，每次5 min。使用SRXN1（Mouse，Santa Cruz，sc-514940）抗体孵育，4 ℃下摇床过夜。0.1%TBST 润洗NC 膜3 次，每次5 min。二抗（Anti-mouse IgG，HRP-linked Antibody，CST，7076S）孵育2 h，0.1%TBST 润洗NC 膜3 次，每次5 min。使用TANON 5200 显影仪进行显影。

1．4 质谱分析将免疫共沉淀后的产物经SDSPAGE 胶分离，考马斯亮蓝染色，纯水脱色后，切取目的胶带，胰蛋白酶消化。后于Q Exactive instrument（Thermo Fisher Scientific）质谱仪上进行质谱分析。使用MaxQuant 软件（版本1.6.5.0）在肽和蛋白质水平上搜索人SwissProt 蛋白质数据库（20 427 个蛋白质）的原始文件，假阳性率＜1%。为实现无标记定量，使用MaxQuant LFQ 算法对质谱信号进行定量，并使用基于蛋白质强度的绝对定量方法iBAQ 表示蛋白质的强度。随后将每个样本的iBAQ 换算为FOT（1 个蛋白质的iBAQ 除以所有识别出的蛋白质的总iBAQ）。使用FOT 乘以106 来表示每个蛋白质的标准化丰度，以3 个重复序列的平均值计算折叠变化，并用t检验来检验统计学意义。

1．5 数据分析利用在线网站Ualcan（http：/ /ualcan.path.uab.edu/）分析SRXN1 在CRC 患者中的mRNA水平，利用在线网站GEPIA 2（http：/ /gepia2.cancerpku.cn/）对微卫星稳定型CRC 患者进行预后生存分析，通过在线网站科研者之家（www.home-for-researchers.com）从癌症基因组图谱（TCGA）数据库（https：/ /portal.gdc.com）获得了CRC 患者的RNAseq 数据和临床信息。收集相应通路中包含的基因，通过R 软件GSVA包进行分析，选择参数method＝‘ssgsea’，最后通过斯皮尔曼相关性分析来分析基因与通路得分的相关性。以上所有分析方法和R 软件包均使用v4.0.3 版R软件执行。P＜0.05 被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 SRXN1 在老年CRC 患者组织中高表达且与预后不良相关利用在线网站Ualcan 对SRXN1 在CRC 患者癌旁组织（n＝41）和肿瘤组织（n＝374）中的表达水平进行差异分析，结果如图1a 所示，CRC 患者组织中SRXN1 的mRNA 表达水平高于癌旁组织（P＝1E－12）。进一步分析SRXN1 在不同年龄段中的表达水平，结果如图1b 所示，SRXN1 的mRNA 水平在大于60 岁患者的CRC 组织中上调（61～80 岁，P＝1.62E－12；81～100 岁，P＝1.72E－05）。利用在线网站GEPIA 2 对微卫星稳定型老年CRC 患者进行预后生存分析发现（图1c），SRXN1 高表达与老年CRC 患者预后不良显著正相关（P＝0.026）。以上发现提示SRXN1 在老年CRC 中是潜在的抗肿瘤分子靶点。

图1a CRC 患者组织中SRXN1 的mRNA 表达水平高于正常组织

图1b 老年（≥60 岁）CRC 患者组织中SRXN1 的mRNA表达水平升高

图1c SRXN1 高表达与老年CRC 患者预后不良呈正相关

2．2 SRXN1 在CRC 中与多种肿瘤信号通路存在相关性利用TCGA 数据库，收集相关通路中包含SRXN1 的基因集合，根据ssGSEA 算法，依次计算每条通路上每个样本的富集分数，从而得到样本和通路之间的联系，通过斯皮尔曼相关分析计算SRXN1 表达与通路得分相关性。如图2所示，SRXN1 在CRC中富集到9 个相关功能通路，包括ROS 通路（P＝2.66E－16，Spearman＝0.32）、IL-10 抗炎通路（P＝0.013，Spearman＝0.10）、EMT 标记基因（P＝0.011，Spearman＝0.10）、P53 信号通路（P＝0.001，Spearman＝0.13）、胶原蛋白形成（P＝0.001，Spearman＝0.13）、ECM 降解（P＝1.08E－05，Spearman＝0.18）、DNA 复制（P＝0.022，Spearman＝0.09）、血管生成（P＝0.011，Spearman＝0.10）、炎性反应（P＝0.029，Spearman＝0.09）。其中ROS 通路相关性最高（Spearman＝0.32），表明SRNX1 与氧化应激功能关系最密切。

图2 SRXN1 在CRC 中所富集的信号通路

2．3 利用质谱分析SRXN1 相互作用蛋白为进一步探索SRXN1 在老年CRC 发生发展中的功能，揭示其作用机制，本研究进一步鉴定其相互作用蛋白。在SW480 细胞系中进行免疫共沉淀，取部分最终纯化样品进行Western blotting 验证。如图3所示，加入IgG组作为对照组，可见加入内源性SRXN1 抗体富集到目标SRXN1 蛋白，而对照组位置未出现条带，表明成功富集到内源性SRXN1 蛋白。

图3 免疫共沉淀成功富集到SRXN1 蛋白

进一步利用质谱分析筛选出新的可能与SRXN1相结合的蛋白75 个（P＜0.05），将实验组与对照组中蛋白丰度比值由高到低排列，前15 个相互作用蛋白如表1所示，分析发现，15 个蛋白中ARMC8、GID8、MAEA 和MKLN1 均为CTLHE3 泛素连接酶复合体的组成亚基。上述分析提示SRXN1 与CTLH 复合体间可能存在相互作用。

表1 质谱分析筛选出与SRXN1 相互作用的15 个主要蛋白

3 讨论

已有研究表明，SRXN1 在肿瘤发生发展中发挥重要作用。在肝癌中，SRXN1 通过ROS/p65/BTG2信号通路促进肿瘤发生与转移［8］；在宫颈癌中，SRXN1 通过Wnt/β-catenin 信号传导途径促进肿瘤的转移［9］。在结直肠癌中，SRXN1 可以通过激活EGFR通路及调控mi143-Fascin 轴促进CRC 的侵袭转移［10-11］。本研究利用在线生信网站分析发现，SRXN1在老年CRC 患者中高表达，并且SRXN1 的高表达与老年CRC 患者预后不良密切相关。进一步分析发现，SRXN1 在CRC 中与多种肿瘤信号通路存在相关性，提示SRXN1 可作为一个潜在的老年CRC 的治疗靶标和有前景的肿瘤标志物［12-13］。因此，去寻找SRXN1 相互作用蛋白进一步揭开它的蛋白网络，为了解SRXN1的功能及其功能调控提供相关信息，有可能成为老年CRC 治疗的突破口。

质谱鉴定发现，SRXN1 潜在的75 个相互作蛋白中有7 个为CTLH E3 泛素连接酶复合体的构成亚基。该复合体包括11 个已知成员：ARMC8、GID4、GID8、MAEA、MKLN1、RMND5A、RMND5B、RANBP9、RANBP10、WDR26 和YPEL5，并且已显示出E3 泛素连接酶活性［14］。CTLHE3 泛素连接酶所调控的底物降解与各种细胞生理和病理过程均密切相关，包括增殖、生存、程序性细胞死亡、细胞粘附和迁移等［15］。有研究报道，在CRC 细胞系HCT116 和HT29 中下调CTLH 复合体中的核心亚基RANBP9 显示出对肿瘤增殖和迁移的促进作用［16-17］，提示CTLH 复合体可能在CRC 发生发展中发挥抑癌蛋白作用。因而本研究鉴定到的CTLH 复合体极有可能通过其泛素连接酶活性介导SRXN1 的泛素化降解从而抑制CRC 的增殖、侵袭及转移，进而影响CRC 患者的生存预后。鉴定到的蛋白是否能与SRXN1 蛋白特异结合及其调控机制仍需进一步实验证实。此外，在鉴定到的SRXN1 潜在的75 个相互作用蛋白中，HMGA1 也被报道可促进CRC的增 殖 和侵袭转移［18］，HMGA1 与SRXN1 在调控CRC 的发生发展中是否发挥协同作用及相关机制还有待研究。

总之，本研究发现提示，SRXN1 在老年CRC 发生发展中具有重要作用，是有应用前景的治疗靶标和预后标志物。通过筛选SRXN1 在CRC 中的相互作用蛋白，将为进一步阐明SRXN1 在CRC 中的功能提供参考，为老年CRC 患者的靶向治疗提供科学依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。