“三穴五针法”针刺对支气管哮喘小鼠肺组织铁代谢紊乱的影响

汤蔚峰，魏颖，张晓丽，王文倩，刘宝君

1.复旦大学附属华山医院中西医结合科，上海 200040；2.复旦大学中西医结合研究院，上海 200040；3.复旦大学附属华东医院肾内科，上海 200040

支气管哮喘是1 种气道异质性慢性炎症性疾病，其患病率及发病率呈逐年增高趋势［1-2］。据报道［3-4］，老年性哮喘的发病率仅次于儿童哮喘，我国已步入老龄化社会，老年性哮喘患者随着年龄的增长而增加。哮喘属于慢性呼吸系统疾病，病程长，需要长期接受糖皮质激素和β2 受体激动剂治疗，而长期使用糖皮质激素常伴随严重的不良反应，如白内障、青光眼、高血压以及骨质疏松等，导致老年哮喘患者的生存质量降低，同时也增加公共卫生支出负担［5］。因此，迫切需要寻求更有效的治疗方法，控制哮喘急性发作，改善哮喘患者的生活质量。

针灸在治疗支气管哮喘方面具有明显的优势，其操作简单、成本较低、疗效显著、不良反应少，其临床疗效已经得到国际公认。“三穴五针法”是邵经明教授积60 余年临床经验治疗哮喘取穴的经典处方，取穴位有：大椎、风门（双侧）、肺俞（双侧）［6］。肺俞属于足太阳膀胱经，为主穴，具有调肺气、止咳嗽、实腠理的作用；大椎属督脉穴，为诸阳之会，有宣阳解表，宣肺平喘的作用；风门属于足太阳膀胱经，有镇咳平喘的作用［6］。既往研究［7］表明，“三穴五针法”针刺可以改善哮喘患者肺功能，降低气道的高反应性，但目前关于“三穴五针法”针刺治疗哮喘的机制尚不清楚。有研究［8］报道，哮喘患者血浆中的铁代谢水平发生了变化，铁代谢在铁死亡中发挥重要作用［9］，而本团队前期研究［10］，发现针刺治疗哮喘机制或与铁死亡具有相关性，但铁代谢是否参与“三穴五针法”针刺治疗哮喘的机制尚不明确。

本实验通过“三穴五针法”针刺干预支气管哮喘小鼠，观察该疗法的抗哮喘作用及对哮喘小鼠肺组织中铁代谢紊乱的影响，旨在进一步揭示“三穴五针法”针刺治疗哮喘的作用机制，为相关研究提供参考。

1 材料与方法

1．1 实验动物健康雌性SPF 级BALB/c 小鼠40 只（采购于上海杰斯捷实验动物有限公司），6～8 周龄，体质量（18 ±2） g。所有小鼠饲养于复旦大学药学院动物实验中心，在湿度（40%～70%）、温度（20～25℃）的条件下，给予昼夜节律光照，自由饮食。

1．2 主要设备与试剂超声雾化器（江苏鱼跃医疗设备公司），有创小鼠肺功能仪器（美国DSI 公司），离心机（美国BEKMAN 公司），冷冻组织研磨仪（上海必横生物科技有限公司），制冰机（常熟市XUEKE电器有限公司），光学显微镜（日本尼康株式会社），实时荧光定量PCR 仪（美国Thermo Fisher 公司），高速梯度PCR 仪（德国耶拿公司），快速转膜仪（南京金斯瑞生物科技有限公司），Western blot 电泳仪、SDS-PAGE 电泳设备、显影仪（美国Bio-Rad 公司），卵清蛋白（美国Sigma 公司），组织裂解液（武汉塞维尔生物有限公司），RNA 抽提试剂盒（上海慧念生物科技有限公司），逆转录试剂盒［宝日医生物技术（北京）有限公司］，扩增试剂盒（武汉爱博泰克生物科技有限公司）。

1．3 动物分组及哮喘模型建立小鼠适应性喂养1周后，按数字表法随机分为4 组，10 只/组：正常对照组（normal control group，NC），哮喘模型组（asthma group，A），针刺组（asthma ＋acupuncture group，AA），假针刺组（asthma ＋sham acupuncture group，ASA）。正常对照组小鼠不给予任何干预；哮喘模型组小鼠在第0 天及第7 天给予200 μL 致敏液（20 μg OVA ＋2 mg氢氧化铝）腹腔注射，使小鼠处于致敏状态。第14～16 天给予3%卵蛋白超声雾化吸入，每次30 min左右，至激发液雾化尽为止，每次20 min；隔间7 d 后，第21～23 天再次给予3%卵蛋白超声雾化吸入；针刺组小鼠在哮喘造模的基础上于21～23 d 进行针刺（大椎、双侧风门、双侧肺俞）；假针刺组小鼠则在哮喘造模的基础上于21～23 d 针刺双侧环跳穴［11-12］。穴位的定位依据参考了《实验针灸学》［13］、以及李辞蓉等［14］和刘海涛等［15］的相关研究。所有动物实验按照复旦大学实验动物管理条例进行，经由复旦大学药学院实验动物伦理委员会批准。

1．4 肺功能检测及动物样本采集在末次激发24 h后，对小鼠进行取材。按照50 mg/kg 戊巴比妥钠用量对小鼠进行麻醉，之后使用DSI 有创小动物肺功能仪检测小鼠肺气道阻力及肺顺应性，使用乙酰甲胆碱进行激发，浓度梯度为：0、3.125、6.25、12.5 mg/mL；肺功能检测后，对小鼠进行脱颈处死，取右肺中叶，于4%的多聚甲醛中固定24 h，之后进行石蜡包埋，切片，予HE 及PAS 染色；其余肺组织置于－80 ℃冰箱中冻存备用。

1．5 HE 染色及PAS 染色分析

1.5.1 HE 染色分析 每张切片选取3 个及以上视野进行观察，观察气道周围的炎症细胞浸润，对气道炎症进行评分，评分采用盲法（未知分组），由3 个人进行独立评分，取平均值进行统计。评分标准分为0～4分，共5 个等级［16-17］，具体见表1。

表1 小鼠肺组织HE 气道炎症评分表

1.5.2 PAS 染色分析 每张切片选取3 个以上视野进行观察，用Image J 记录气道上PAS 阳性染色的细胞数，同时记录整个气道的细胞数，计算阳性细胞占全部气道细胞数的比值，以此比值为评估PAS 染色的参考数据［18］。

1．6 蛋白质免疫印迹检测小鼠肺组织中铁代谢相关蛋白的表达从－80 ℃冰箱中取出备用的肺组织，解冻后取20 mg，制备成终浓度为3 μg/μL 的蛋白样品。蛋白样品上样量为30 μg，电泳（80 V，15 min；130 V，40 min）；电泳后使用快速转膜仪转膜（17 min）；转膜后的PVDF 膜使用快速封闭液进行封闭（室温，20 min）；封闭完毕后，将PVDF 膜置于配制好的一抗溶液中进行孵育（4 ℃，过夜）；一抗孵育完毕后，TBST 洗脱3 次（10 min/次），进行二抗孵育（室温，90 min）；TBST 洗脱3 次（10 min/次），将需要显影的条带浸润于显影液中，10 s 后将条带放入显影仪中显色；显影所得条带用Image J 分析，计算各个目的条带及内参的灰度值，以目的蛋白灰度值/内参灰度值为最终统计分析的数据。抗体信息见表2。

表2 抗体信息

1．7 实时荧光定量PCR 检测铁代谢相关蛋白编码基因mRNA 水平从－80 ℃冰箱中取出备用肺组织，解冻后取20 mg，按照RNA 抽提试剂盒抽提肺组织总RNA，抽提完的RNA 进行逆转录，20 μL 体系，27 ℃，15 min；85 ℃，5 s；降温至4 ℃。逆转录完毕，按照20 μL 体系进行扩增，95 ℃，3 min，1 个循环；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，40 个循环。记录CT 值后进行分析。所使用的引物序列见表3。

1．8 统计学分析使用软件GraphPad Prism 7 （Graph-Pad software，San Diego，Calif.）进行统计分析。数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 “三穴五针法”针刺改善哮喘小鼠的肺功能对小鼠的气道阻力（Airway resistance，RL）及动态肺顺应性（Dynamic respiratory compliance，Cdyn）进行检测，以评估“三穴五针法”针刺对哮喘小鼠肺功能的影响。如图1A 所示，与正常对照组小鼠比较，哮喘组小鼠气道阻力显著增高，在Mch 浓度为6.25 mg/mL 和12.5 mg/mL 时，存在显著性差异；而如图1B 所示，与正常对照组小鼠比较，哮喘组小鼠的肺顺应性显著降低，在Mch 浓度为6.25 mg/mL 和12.5 mg/mL 时，存在显著性差异，以上实验结果说明哮喘造模成功。在针刺干预后，与哮喘组小鼠相比较，针刺组小鼠的气道阻力在Mch 浓度为6.25 mg/mL 和12.5 mg/mL 时显著降低，而肺顺应性则在Mch 浓度为12.5 mg/mL时显著增高。以上结果说明，“三穴五针法”针刺改善哮喘小鼠的肺功能。此外，假针刺组与哮喘模型组小鼠在RL及Cdyn 上无明显差异。

图1 “三穴五针法”针刺对小鼠肺功能的影响

2．2 “三穴五针法”针刺改善哮喘小鼠肺组织炎症浸润和杯状细胞化生采用HE 染色对小鼠肺组织中炎症浸润程度进行评估，结果发现，如图2A 所示，与正常对照组比较，哮喘模型组气道周围存在明显的炎症浸润，而针刺干预后，小鼠肺组织炎症浸润程度明显减轻，假针刺组则与哮喘模型组无差异。对HE 染色的小鼠肺组织切片进行炎症评分，其数据也支持上述结果（图2B）。采用PAS 染色评估小鼠肺组织中的杯状细胞化生程度，结果如图2A 及图2C 所示，与正常对照相比较，哮喘模型组小鼠肺组织PAS 阳性细胞染色占比显著增加，针刺干预后，小鼠肺组织的PAS 阳性细胞占比显著降低，而假针刺组则与哮喘模型组无差异。以上结果提示，“三穴五针法”针刺改善哮喘小鼠肺组织炎症浸润和杯状细胞化生。

图2 “三穴五针法”针刺对哮喘小鼠肺组织病理的影响

2．3 “三穴五针法”针刺治疗哮喘的作用与铁代谢相关

2.3.1 肺组织铁代谢相关蛋白表达检测 转铁蛋白受体（Transferrin receptor，TFR1）、二价金属离子转运体（Divalent metal transporter 1，DMT1）、铁蛋白（Ferritin）、膜铁转运蛋白（Ferroportin，FPN）是存在于哺乳动物体内与铁代谢相关的蛋白。通过WB 技术对小鼠肺组织中的TFR1、DMT1、Ferritin、FPN 表达水平进行了验证，结果如图3所示：与正常对照组比较，哮喘模型组小鼠肺组织中TFR1、DMT1 和Ferritin 表达水平显著增高，而FPN 的表达水平显著降低；针刺干预后，与哮喘模型组比较，TFR1、DMT1 和Ferritin 的表达水平显著降低，而FPN 的表达水平则显著增高；而假针刺组则与哮喘模型组无明显差异。以上结果提示，“三穴五针法”针刺治疗哮喘的作用或与铁代谢相关。

图3 铁代谢相关蛋白表达水平检测

2.3.2 肺组织铁代谢相关基因mRNA 水平检测 为进一步明确铁代谢参与“三穴五针法”针刺治疗哮喘的机制，采用qRT-PCR 技术对铁代谢相关蛋白的编码基 因TFR1、TFR2、ZIP14、FTL、FTH、NRAMP1、HEPC1 在小鼠肺组织中的mRNA 水平进行了验证，结果显示如图4所示，与正常对照组比较，哮喘模型组小鼠肺组织中的TFR1、TFR2、ZIP14、FTL、FTH、NRAMP1、HEPC1 mRNA 水平显著增高；针刺干预后，与哮喘模型组比较，小鼠肺组织中的TFR1、TFR2、ZIP14、FTL、FTH、NRAMP1、HEPC1 mRNA 水平显著降低；假针刺组与哮喘组无明显差异。

图4 铁代谢相关蛋白编码基因qRT-PCR 结果

3 讨论

本研究首先通过小鼠肺功能检测，小鼠肺组织HE 及PAS 染色法明确了“三穴五针法”针刺对哮喘的治疗作用。结果表明“三穴五针法”针刺显著改善了哮喘小鼠的肺功能，降低了哮喘小鼠肺组织的炎症浸润水平及杯状细胞化生程度。进一步实验结果表明，“三穴五针法”针刺可以显著减轻哮喘症状，改善哮喘小鼠肺组织的病理改变，其机制可能与调控铁代谢相关分子的表达相关。

近年来的研究表明，铁代谢在支气管哮喘发病中发挥重要作用。哮喘患者血浆的铁水平与哮喘的症状具有相关性，且铁螯合剂可以改善哮喘小鼠的呼吸道症状［8］。同时，铁代谢也是铁死亡相关的重要生物学进程。机体内的铁主要由肠道吸收二价铁（F2＋），F2＋转化为三价铁（F3＋）后，经由转铁蛋白（Transferrin，TF）及膜蛋白转铁蛋白受体1（TFR1）转入胞内。胞内的F3＋被还原成F2＋，经由二价金属转运蛋白（DMT1）或者锌铁调控蛋白14（ZRT/ IRT-like proteins 14，ZIP14）介导F2＋与铁蛋白（Ferritin）结合，储存在细胞内，铁蛋白由铁蛋白重链（Ferritin heavy chain，FTH）和铁蛋白轻链（Ferritin heavy chain，FTL）组成［19］。而多余的铁将由膜铁转运蛋白（FPN）输出到血液中，参与铁的再循环，FPN 是哺乳动物体内唯一的铁输出蛋白［20］。F2＋不稳定，可以通过芬顿反应，产生羟自由基（·OH），促进脂质过氧物和氢过氧化物的合成，造成细胞膜的破坏，进而诱导铁死亡［21］。既往研究表明，铁超载条件下铁调素（Hepcidin，HEPC1）的表达水平增高，而在铁缺乏条件下，铁调素的表达降低［22］，此外，其可以负向调节FPN 的表达［23］，是铁稳态的负向调节机制。天然抗性相关巨噬细胞蛋白1（Natural resistance-associated macrophage protein 1，NRAMP1）是二价铁的吞噬酶体转运体，参与铁的代谢［24］。

实验发现，在OVA 诱导的哮喘模型中，铁转入蛋白TFR1、DMT1 和铁储存蛋白Ferritin 发生了高表达，铁转出蛋白FPN 发生了低表达，说明在哮喘模型中，肺组织发生了铁过载。同时ZIP14、TFR1、TFR2、FTL、FTH、HEPC1、NRAMP1 mRNA 水平的增高也支持肺组织铁水平的增高的结论。而既往的研究表明，哮喘患者体内发生了铁过载，哮喘患者血浆中的铁水平显著高于正常人［25］，铁死亡抑制剂Ferrostatin-1 可以通过抑制TFR1、DMT1 表达，改善哮喘的症状［26］。在针刺干预后，与哮喘模型组相比，小鼠肺组织中铁转入蛋白TFR1、DMT1 和铁储存蛋白Ferritin 发生了低表达，而铁转出蛋白FPN 发生了高表达，说明肺组织中铁的摄入减少，铁的排出增多，肺组织铁水平下降［20］。qRT-PCR 结果显示，针刺降低ZIP14、TFR1、TFR2、FTL、FTH、HEPC1、NRAMP1 mRNA 水平。

本实验发现，“三穴五针法”针刺可以调节OVA诱导的哮喘小鼠肺组织铁代谢紊乱，调控铁代谢相关分子的表达水平，这可能是“三穴五针法”针刺治疗哮喘的机制之一，为相关研究提供了新的思路。现有的研究仍有不足之处，一是针刺调控小鼠肺组织的铁代谢的途径尚未明确；二是尚不清楚针刺是否通过调节肺组织的铁代谢影响肺组织细胞的铁死亡发挥治疗哮喘的作用。在后续的研究中，计划对铁代谢调节分子的上游分子进行检测，同时增加铁死亡的相关指标检测，以进一步阐明“三穴五针法”针刺治疗哮喘与肺组织铁代谢紊乱调节的关联。