新疆柳树花变叶植原体分子鉴定

李 丰赖刚刚赵志慧张 萍朱天生

(塔里木大学植物科学学院,南疆农业有害生物综合治理兵团重点实验室/南疆特色果树高效优质栽培与深加工技术国家地方联合工程实验室,新疆阿拉尔 843300)

柳树(Willow)是杨柳科(Salicaceae),柳属(Salix)的总称,属乔木或灌木,全世界约520种,柳树在中国栽培历史悠久,全国各地均有分布,主要栽培品种250多种[1]。柳树分布范围广,用途广泛,不仅可以作为木材资源,还可用于园林绿化、防风固沙和医药等领域,特别是对于干旱地区荒漠化治理有重要作用。此外,由于近年来全球能源短缺,柳树生长速度快,生物量积累较多,对于一些短轮伐期速生柳来讲,具有潜在的开发潜力[2]。

植原体(Phytoplasma)是一类专性寄生于植物韧皮部或半翅目昆虫体内,目前尚难以人工体外纯培养的原核微生物,主要由刺吸式口器昆虫(飞虱、叶蝉等)传播[3]。植原体已经在全球引起1 000多种病害,中国已报道的有100多种[4],主要包括园艺作物、花卉、林业和农业经济作物,严重威胁世界农林业发展安全。近年来,柳树丛枝病在我国西北部分地区普遍发生,甘肃、内蒙和新疆已见报道。1992年王纯利等[5]通过电子显微镜对新疆柳树丛枝病病原进行初步观察鉴定,认为该病原为类菌原体(Mycoplasma-like Organism,简称MLO)。2005 年朱天生[6]对采自塔里木大学校园内的柳树花变叶植原体病害进行了分子鉴定,确定了其分类地位,并将其命名为柳树花变叶植原体(Willow phyllody phytoplasma)。李岩峰等[7]报道了甘肃酒泉柳树也表现出丛枝、小叶和枝条增殖等症状,并对其进行防治试验研究。Zhang等[8]对内蒙鄂尔多斯市表现增殖和丛枝的柳树进行了分子检测和鉴定,并首次将中国柳树植原体病害鉴定到16Sr VI组[8]。国内报道的柳树植原体病害除丛枝、花变叶和增殖外,Wei等[9]报道的陕西柳树植原体病害为典型的黄化症状。此外,Mou等[10]在云南省元谋县发现了小叶柳(Salix tetradenia)丛枝与畸形。前期通过对新疆乌鲁木齐、伊犁、五家渠、阿克苏、和田、阿拉尔、巴州和喀什等地区调查发现,柳树花变叶和丛枝在新疆各地州普遍发生。本研究拟通过分子生物学手段鉴定新疆柳树花变叶病病原,利用16S r RNA 和tuf基因一致性分析,构建系统发育树将其分类到亚组水平,并分析不同地区柳树花变叶植原体16S r RNA 基因的差异性,以期为柳树植原体病害防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

采自和田市、阿拉尔市、喀什莎车县、克州阿图什市、巴州轮台县、阿克苏温宿县和图木舒克市的表现花变叶和丛枝症状的柳树。取发病枝条韧皮部,经灭菌水处理后,吸水纸吸干水分,自封袋分装后置于-80 ℃冰箱,备用。阳性对照枣疯病(‘Jujubew Witches’-broom Phytoplasma)样品,由山东省果树研究所高瑞副研究员提供。Taq DNA Polymerase、d NTPs(2.5 mmol/L)和10×PCR buffer购自北京全式金生物技术有限公司,DNA Marker 2000、DiaSpin胶回收试剂盒及引物均购自上海生物工程有限公司。

1.2 DNA提取

取0.1～0.2 g柳树韧皮部组织,采用CTAB法提取总DNA[11-12]。采用Thermo ND-2000微量分光光度计检测DNA 浓度,琼脂糖凝胶电泳检测DNA 完整性,将检测合格的DNA 置于-20 ℃保存,备用。

1.3 16Sr RNA和tuf 基因PCR扩增

植原体16Sr RNA 基因扩增采用Lee等[13]和Gundersen 等[14]所报道的植原体通用引物R16mF2/R16m R1和R16F2/R16R2分别进行直接PCR 和巢式PCR,tuf基因扩增采用Schneider等[15]报道的引物对f Tuf/r Tuf,引物序列如下(表1)。反应体系均为25μL,其中10×PCR buffer 2.5 μL、10 μmol/L 引物各1 μL、10 mmol/L d NTPs 1 μL、TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)0.5μL、模板DNA 1μL。直接PCR 结束后,将PCR 产物稀释30倍,取1μL 作为巢式PCR 模板。16Sr RNA 基因直接PCR 扩增反应条件为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s;55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min;共30个循环,最后72 ℃延伸10 min;巢式PCR 条件将退火温度设为57 ℃,其他均与第一次扩增相同。

表1 PCR 引物Table 1 Primer of PCRs in this study

tuf基因PCR 扩增反应条件为:94℃预变性3 min;94 ℃变性30 s;55℃退火30 s,72℃延伸1 min;共35个循环,最后72 ℃延伸10 min。以健康的柳树总DNA 为阴性对照,栆疯病DNA 为阳性对照,无菌双蒸水为空白对照。PCR 产物在0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,观察结果。

1.4 PCR产物纯化及测序

使用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒将目标条带进行切胶回收后,送上海生物工程有限公司进行测序。

1.5 序列比对和虚拟RFLP分析

利用DNAStar Seq Man 软件对获得的序列进行校正及拼接后,提交到GenBank中获得基因序列号。在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中对获得的基因序列Blast在线比对获得同源序列,通过MEGA7.0 软件构建系统进化树,Boot strap重复数为1 000[16]。利用植原体在线分类工具(iPhyClassifier(https://plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/reso-urce/iphyclassifier.cgi)对获得的16S r RNA 序列进行相似性系数分析和虚拟RFLP分析[17]。

2 结果与分析

2.1 感病柳树表现症状

柳树在初春时期,枝条顶端未展开,多表现为丛枝症状(图1-A～1-C);4 月花期,柳树花序畸形,表现为花变叶,随着其生长,后期形成不规则疙瘩形状(图1-D～1-F);7-8月由于高温枝条顶部水分及营养物质供应不足,导致病部及以上部分枝条干枯(图1-G)。

图1 新疆柳树花变叶和丛枝病表现症状Fig.1 Symptoms of willow phyllody and witches’-broom disease in Xinjiang

对新疆7个地区表现花变叶和丛枝的柳树植株总DNA 经PCR 扩增后,1%琼脂糖电泳检测结果表明,利用引物对R16F2/R16R2 经巢式PCR 扩增到约为1.2 kb的16S r RNA 片段;引物对f Tuf/r Tuf经PCR 扩增得到约800 bp特异性条带,dd H2O 空白对照与健康对照均为扩增出特异性条带(图2)。

图2 柳树花变叶植原体16S r RNA 和tuf 基因PCR 检测结果Fig.2 PCR detection results of 16S rRNA and tuf gene of willow phyllody phytoplasma

2.2 16S r RNA序列比对及系统进化树分析

经测序结果表明,来自7个地区柳树病样扩增得到的11条16S r RNA 基因片段长为1 235～1 240 bp,将序列提交到GenBank登录号分别为:MW411190、MW411193～MW411201、MW390640。利用Meg Align软件对7个地区白柳花变叶植原体16S r RNA 基因序列一致性比较发现,G+C含量为45.6%,序列一致性为99.4%～100.0%(表2)。BLAST 分析表明,柳树花变叶植原体16S r RNA 序列与榆树黄化组(EY)植原体文冠果丛枝(‘Xanthoceras sorbifolia’Bunge witches’-broom phytoplasma,GenBank Accession No.KC331045)和桃黄化(‘Prunus persica’yellows phytoplasma,Accession No.KF523370)同源性为99.76%。初步确定柳树花变叶植原体属于16Sr V 组。系统进化树显示,柳树花变叶植原体与榆树黄化组(16Sr V)组植原体聚为一枝,亲缘关系最近,进一步确定该植原体为16Sr V 组成员(图3)。

图3 基于新疆柳树花变叶植原体16S r RNA(左)和tuf 基因(右)序列以及相关植原体株系构建系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S r RNA(left)and tuf (right)gene sequences of willow phyllody phytoplasma from Xinjiang and other related phytoplasma

表2 利用MegAlign对7个地区11条16S rRNA 序列一致性的分析Table 2 Analysis of sequence identity of eleven 16S r RNA in seven regions by use of MegAlign%

2.3 tuf 基因序列比对及系统进化树分析

从和田白柳、龙爪柳、阿拉尔白柳和阿克苏龙爪柳病样中PCR 扩增出的4个tuf基因片段经测序得到824 bp的序列,GenBank登录号分别为MW435399～MW435402。将该序列与NCBI数据库的同源序列进行比对,结果表明,该序列与枣疯病(GenBank 登录号:GU137287)的tuf基因序列相似性为98.3%,采用邻近法构建系统进化树表明,柳树花变叶植原体tuf基因序列与榆树黄化组植原体聚为一枝,与中国樱桃黄化致死(GenBank登录号:KJ452549)亲缘关系最近,属于榆树黄化组(EY)的tufV-B亚组。

2.4 16S r RNA虚拟RFLP分析

柳树花变叶植原体16S r RNA 虚拟RFLP分析结果表明,该植原体16S r RNA 基因片段的限制性片段长度多态性与枣疯病株系(Gen Bank登录号:AB052876)有99.8%的相似性,虚拟RFLP模式与16Sr V-B亚组的参考模式相同,相似系数为1.00。进一步证明柳树花变叶植原体为16Sr V-B亚组成员。

3 讨论

本研究以在新疆发现的表现出丛枝和花变叶的柳树为材料,通过16S r RNA 基因和tuf基因进行PCR 扩增、构建系统进化发育树以及16S r RNA 虚拟RFLP分析,结果显示,在新疆地区发现的柳树花变叶属于植原体病害16Sr V-B 亚组成员。

柳树在新疆分布广泛,品种较多。作为园林绿化和园艺观赏树种,对干旱地区防风固沙和水土保持有重要作用。近年来,柳树植原体病害在国内外不断被发现并报道,云南、陕西、内蒙、甘肃和新疆均已见报道,分别属于16SrΙ-B、16SrΙ-C和16Sr VI-A 组,引起症状有黄化、小叶、丛枝、增殖和花变叶[18-20]。伊朗和印度也发现该病害,研究人员报道该病害与植原体有关[21-23]。这是首次报道柳树花变叶病害与16Sr V-B 亚组植原体有关。

1992年王纯利等[5]首次报道新疆柳树植原体病害,并将其命名为柳树丛枝病;朱天生[6]在山东对柳树植原体病害进行了报道,将其命名为柳树花变叶植原体;魏婷等[18]在陕西报道的柳树植原体病害症状主要表现为黄化;自1992以来,该病害在新疆各地区不断被发现,其发病不断加重。Luan等[20]在2005 年对新疆柳树花变叶植原体病害进行了调查,结果显示,喀什及阿克苏地区发病率达到60%,和田及阿拉尔地区近50%,巴州地区近10%。该病害在新疆不同地区、不同柳树品种上发病程度有所差异,严重者则树体顶枯,但尚未发现有整株死亡现象。植原体感染柳树后,部分柳树在不同时期症状表现也不同,如白柳,春季有花变叶、丛枝症状混合发生,夏秋两季多表现为丛枝症状。经过研究发现,花变叶和丛枝症状植原体16S r RNA 和tuf基因序列间无差异,这与植原体能引起寄主植物多种症状的特性相符。但这是否与其他功能基因有关,仍需进一步研究。该病害自发现以来,一直未见其传播介体的报道。由于其分布广,防治困难,再考虑到柳树的经济效益较低,因此,该病害的研究较为滞后,目前亟待有效控制该病害的措施,以控制该病害传播,减少林业损失。