星点设计-响应面法优化黄芪甲苷二元醇质体处方及其理化性质考察

吴少媛，冯玉天娇 ，陈筱瑜，黄庆德

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建卫生职业技术学院药学院，福建 福州 350101）

黄芪甲苷（astragaloside Ⅳ，ASIV）为中药黄芪主要活性成分之一，具有免疫调节、抗氧化、抗病毒、抗纤维化、抗细胞凋亡、抗肿瘤等药理作用［1］。近年来有研究表明，ASIV 可有效保护皮肤成纤维细胞免于长波紫外线引起的氧化损伤，达到延缓皮肤光老化的作用［2-5］，且当ASIV浓度为10 μg/mL时，促进皱纹和非皱纹皮肤成纤维细胞的增殖作用最为明显［6］。由于ASIV 难溶于水及油脂，在蒸馏水中的溶解度仅为0.01 mg/mL［7］，制成外用制剂用于延缓皮肤光老化时，存在经皮渗透性差及难以在皮肤达到有效浓度的问题。所以，应用新的制剂技术来提高ASIV 的溶解度，并改善其经皮渗透性能具有重要意义。二元醇质体是用二元醇（乙醇、丙二醇）制备醇质体，与普通醇质体比较，减少了乙醇用量，增加稳定性，降低对皮肤（黏膜）的刺激性，可以发挥两者协同促进透皮吸收的作用，增加药物的透皮吸收并提高药物在皮肤中的滞留量［8-9］。本实验在单因素实验的基础上，采用星点设计-响应面法对ASIV 二元醇质体处方进行优化，并对其理化性质进行考察，为制备ASIV 二元醇质体凝胶剂的研究提供实验数据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 EasySep®-3030 高效液相色谱仪-UM5800 蒸发光散射检测器（上海通微分析技术有限公司）；MPLR-702 恒温磁力搅拌器（常州市金坛大地自动化仪器厂）；BT100-1F 蠕动泵（保定兰格恒流泵有限公司）；STARTER3100 PH 酸度仪（美国OHAUS 公司）；FA2004N 万分之一电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；XS205 十万分之一电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；NICOMP 380ZLS 纳米粒度及电位分析仪（美国PSS粒度仪公司）；H7650 透射电子显微镜（日本HITACHI 公司）；UFC5003BK 超滤离心管（美国 Merck Millipore 公司）。

1.2 试药 ASIV对照品（纯度≥98%）、ASIV原料药（纯度98%）、聚山梨酯-80（上海源叶生物科技有限公司，批号：J25F10T81373、C14J9Q65734、Z17D9Y77 731）；大豆卵磷脂［艾伟拓（上海）医药科技有限公司，批号：SY-SI-190602］；磷酸二氢钾（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10419856）；磷酸、无水乙醇、丙二醇、甲醇、乙腈（国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水；甲醇、乙腈均为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 ASIV 二元醇质体制备 准确称取处方量的ASIV、大豆卵磷脂、聚山梨酯-80、二元醇（乙醇-丙二醇），置锥形瓶中，在室温密闭条件下，搅拌20 min至完全溶解，为A 相。设置搅拌速度为700 r/min，将处方量的超纯水（B 相）以1 mL/min 的速度缓慢加入A 相中，结束后继续搅拌90 min，冷却至室温，即得ASIV 二元醇质体，4 ℃条件下保存。同法制备空白二元醇质体。

2.2 HPLC-ELSD 测定ASIV 含量方法的建立

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈∶水（36∶64）；温度：70 ℃；压力：3.89 bar；信号：30 mV；气体流量：2.50 L/min；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称定ASIV 对照品适量，置25 mL 量瓶中，加甲醇超声溶解，冷却至室温后用甲醇稀释至刻度，0.22 μm 微孔滤膜滤过，得浓度为 992.00 μg/mL 的 ASIV 对照品母液，备用。

2.2.3 供试品溶液制备 精密吸取3 mL ASIV 二元醇质体，置10 mL 量瓶中，加甲醇超声溶解，冷却至室温后用甲醇稀释至刻度，0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.2.4 阴性对照溶液制备 精密量取3 mL 空白二元醇质体，置10 mL 量瓶中，加甲醇超声溶解，冷却至室温后用甲醇稀释至刻度，0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得阴性对照溶液。

2.2.5 专属性试验 将对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液分别注入高效液相色谱仪，按“2.2.1”项下的色谱条件检测，结果见图1。由图可知，在该色谱条件下，制备二元醇质体的各辅料对ASIV的含量测定无干扰，专属性好。

图1 高效液相色谱图

2.2.6 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下的对照品母液用甲醇稀释，分别配成浓度为49.60、69.44、89.28、297.60、694.40、992.00 μg/mL 的 ASIV对照品溶液，0.22 μm 微孔滤膜滤过，按“2.2.1”项下的色谱条件进样检测，记录峰面积。以ASIV 的质量浓度C（μg/mL）的对数为横坐标X，以测得的峰面积A 的对数为纵坐标Y，进行线性回归，得回归方程：Y＝1.637X＋8.171，r＝0.999 9。结果表明，ASIV在49.60～992.00 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.2.7 精密度试验 精密吸取“2.2.6”项下浓度为694.40 μg/mL 的对照品溶液，重复进样 6 次，测定峰面积，计算RSD值为0.10%，表明仪器精密度良好。

2.2.8 重复性试验 取同一批ASIV 二元醇质体样品6 份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，测定ASIV 的峰面积，计算 ASIV 含量和RSD值，RSD值为2.99%，表明本方法重复性良好。

2.2.9 回收率试验 取已知浓度的ASIV 二元醇质体1.5 mL，置10 mL 量瓶中，分别加入ASIV 对照品1.913、1.594、1.275 mg，每一浓度水平各 3 份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，测定其峰面积，计算平均回收率和RSD值。结果平均回收率为101.21%，RSD为 1.01%。

2.3 质量评价指标

2.3.1 超滤离心法测定包封率 精密量取0.4 mL ASIV 二元醇质体置于5 mL 量瓶中，用甲醇超声破乳后，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，测定ASIV 含量为W1。精密量取0.4 mL ASIV 二元醇质体置截留分子量为50 kD 超滤离心管中，以 6 000 r/min 离心 60 min［10］，移取全部滤液，置2 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，测定 ASIV 含量为W2，计算包封率。

包封率＝（W1－W2）/W1×100%

2.3.2 粒径、PDI 和Zeta 电位测定 取适量ASIV 二元醇质体，纯化水稀释后用纳米粒度及电位分析仪测定其粒径和Zeta 电位。

2.4 ASIV 二元醇质体处方筛选

2.4.1 聚山梨酯-80 含量对二元醇质体的影响 分别取0.00%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%（W/V）的聚山梨酯-80 及处方量ASIV 和大豆卵磷脂，量取一定比例的乙醇、丙二醇和水，按“2.1”项下方法制备二元醇质体，每组平行制备3 份，按“2.3.1”“2.3.2”项下方法测定包封率（A）、平均粒径（B）、Zeta 电位（C），计算综合评分，综合评分＝Ai/Amax×50＋Bmin/Bi×25＋Ci/Cmax×25，结果见表1。结果表明，聚山梨酯-80 含量为0.75%时的综合评分最高。

表1 聚山梨酯-80 含量对二元醇质体的影响（，n=3）

表1 聚山梨酯-80 含量对二元醇质体的影响（，n=3）

组号1 2 3 4 5 6聚山梨酯-80/%0.00 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50综合评分/分0 89.49 95.61 92.84 90.90 89.12包封率/%—80.33±0.02 78.64±0.01 76.57±0.01 77.89±0.00 71.83±0.01粒径/nm—222.90±1.90 217.40±1.64 188.37±1.96 229.87±1.50 220.97±1.45 Zeta电位/mV—15.27±0.21 20.79±2.02 16.78±1.24 18.24±0.46 19.21±0.31

2.4.2 大豆卵磷脂用量的考察 分别取2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%（W/V）的大豆卵磷脂及处方量ASIV、0.75%聚山梨酯-80，量取一定比例的乙醇、丙二醇和水，按“2.1”项下方法制备二元醇质体，按“2.3.1”“2.3.2”项下方法测定包封率、平均粒径、Zeta电位，计算综合评分，结果见表2。结果表明，大豆磷脂含量为4.0%时的综合评分最高。

表2 大豆卵磷脂含量对二元醇质体的影响（，n=3）

表2 大豆卵磷脂含量对二元醇质体的影响（，n=3）

组号1 2 3 4 5 6大豆卵磷脂/%2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50包封率/%68.24±0.02 74.51±0.02 75.30±0.00 76.64±0.00 85.11±0.00 86.42±0.00粒径/nm 235.60±4.37 259.50±2.00 241.00±2.99 242.40±4.20 223.87±7.18 253.10±0.36 Zeta电位/mV 13.54±0.35 13.93±0.42 14.71±0.13 16.01±0.61 17.35±1.24 16.33±0.14综合评分/分82.74 84.75 87.99 90.50 99.24 95.64

2.4.3 丙二醇和乙醇比例的考察 取处方量ASIV、0.75%聚山梨酯-80 及4.0%（W/V）的大豆卵磷脂，一定比例的二元醇相（乙醇与丙二醇的比例分别为 9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9），按“2.1”项下方法制备二元醇质体，乙醇与丙二醇比例为1∶9 的处方组未形成醇质体，其余8 组于4 ℃冰箱放置，24 h 后乙醇与丙二醇比例为 4∶6、3∶7、2∶8 的处方组均出现不同程度的沉淀，其余5 组仍为醇质体状态，按“2.3.1”“2.3.2”项下方法测定包封率、平均粒径、Zeta电位，计算综合评分，结果见表3。结果表明，乙醇和丙二醇的比例对是否能形成二元醇质体影响较大，当乙醇占二元醇体系含量的50%以下时，无法形成稳定的二元醇质体，当乙醇和丙二醇的比例为8∶2 时，综合评分最高。

表3 乙醇丙二醇比例对二元醇质体的影响（，n=3）

表3 乙醇丙二醇比例对二元醇质体的影响（，n=3）

组号1 2 3 4 5乙醇∶丙二醇9∶1 8∶2 7∶3 6∶4 5∶5包封率/%72.90±0.00 85.66±0.00 82.21±0.01 84.23±0.01 83.36±0.00粒径/nm 268.20±4.19 222.33±0.85 158.67±1.63 192.93±2.02 201.60±0.95 Zeta电位/mV 20.68±0.58 24.27±0.48 16.74±0.79 19.81±0.67 19.89±0.92综合评分/分78.64 92.84 90.23 90.13 88.82

2.4.4 药物含量的考察 分别精密称取0.10%、0.12%、0.14%、0.16%、0.18%、0.20%、0.22%（W/V）的ASIV 及处方量的聚山梨酯-80 和大豆卵磷脂，量取一定比例的乙醇、丙二醇和水，按“2.1”项下方法制备二元醇质体，于4 ℃冰箱放置24 h 后，药物含量为0.16%、0.18%、0.20%和0.22%的处方组出现沉淀，其余组稳定，按“2.3.1”“2.3.2”项下方法测定包封率、平均粒径、Zeta 电位，计算综合评分，结果见表4。结果表明，当药物含量为0.12%时，综合评分最高。

表4 药物含量对二元醇质体的影响（，n=3）

表4 药物含量对二元醇质体的影响（，n=3）

组号1 2 3药物含量/%0.10 0.12 0.14包封率/%86.88±0.00 89.76±0.01 93.03±0.00粒径/nm 209.70±2.34 223.47±3.00 198.97±3.20 Zeta电位/mV 20.68±3.71 22.14±2.70 14.19±0.35综合评分/分95.42 97.26 92.16

2.4.5 星点效应-响应面优化二元醇质体处方

2.4.5.1 星点试验设计 根据单因素筛选实验结果，聚山梨酯-80 的含量为0.75%，药物含量为0.12%，二元醇与水的比例为4∶6。由于大豆卵磷脂含量以及无水乙醇含量对二元醇质体综合评分影响较大，因此选择以大豆卵磷脂含量（X1，W/V）、无水乙醇含量（X2，V/V）为考察因素进行星点设计，因素与水平见表5。以包封率（Y1）与平均粒径（Y2）为指标，并将二者线性归一化［11］，归一值（di）范围分别为 Y1（Ymin＝69.50%，Ymax＝91.28%）、Y2（Ymin＝147.4，Ymax＝347.4）。通过总评归一值 OD［OD＝（d1d2d3…dn）1/n，dmax＝（Yi－Ymin）/（Ymax－Ymin），dmin＝（Ymax－Yi）/（Ymax－Ymin）］评价 ASIV 二元醇质体的质量，Y1对OD 值的贡献根据公式dmax计算其d 值，Y2对OD 值的贡献根据公式dmin计算其d 值。在响应面上直观地读出各因素的最优区间，确定最优处方。试验安排以及结果见表6。

表5 因素水平表

表6 试验安排及结果

2.4.5.2 模型拟合 运用Design-Expert 8.0.6 软件对实验结果进行多元非线性拟合，得到OD 值（Y）对大豆卵磷脂含量（X1）、无水乙醇含量（X2）的响应方程为：Y＝0.75＋0.1X1－0.11X2＋0.17X1X2－0.14X12－0.28X2（2R2＝0.949 0）。对响应方程进行方差分析，结果见表7。该响应方程的P＜0.01，表明该模型方程极显著。在回归模型中的一次项大豆卵磷脂含量（X1）的P＜0.05、无水乙醇含量（X2）的P＜0.01，表明其对OD 值影响显著，影响程度为：乙醇含量（X2）＞磷脂含量（X1）；二次项X12和X22以及交互项X1X2对OD 值的影响均显著（P＜0.01）。该方程的失拟项的P＞0.05，失拟项差异不显著，表明本实验设计可靠，得到的响应面方程可用于ASIV 二元醇质体处方优化。

表7 方差分析结果

2.4.5.3 响应面分析 运用Design-Expert 8.0.6 软件绘制OD 值与变量大豆卵磷脂含量（X1）和乙醇含量（X2）的三维响应面图和二维等高线图，见图2。从图中可知，两因素对OD 值的响应曲面坡度较大，说明2 个因素对OD 值的影响较大，等高线图的形状接近椭圆形，且等高线较密集，说明大豆卵磷脂含量（X1）和乙醇含量（X2）两因素交互作用较显著。

图2 大豆卵磷脂含量与乙醇含量交互作用对OD 值的响应面及等高线图

2.4.5.4 响应面优化和预测 在满足ASIV 二元醇质体OD 值最大化条件下，利用Design-Expert 8.0.6软件优化处方，得到大豆卵磷脂含量及无水乙醇含量的优化值分别为3.86%、27.13%，预测的粒径为220.77 nm，包封率为89.49%。

2.4.5.5 验证试验 按“2.4.5.4”项下最优处方，平行制备6 份ASIV 二元醇质体，分别测定其包封率、粒径，结果见表8。实验值与预测值偏差均＜4%，说明响应方程有较好的预测性，可用于ASIV 二元醇质体处方的优化。

表8 预测值与实验值比较（，n=6）

表8 预测值与实验值比较（，n=6）

指标包封率/%粒径/nm Zeta电位/mV PDI预测值89.490 220.770偏差/%-3.587 2.854——实验值86.280±0.030 227.070±5.030-21.060±0.320 0.172±0.016——

2.5 ASIV 二元醇质体理化性质

2.5.1 ASIV 二元醇质体形态 取适量ASIV 二元醇质体滴加到载有Formvar 支持膜的铜网上，用少量2%磷钨酸负染，自然挥干后，置于透射电子显微镜下观察二元醇质体形态，结果见图3，本品形态规整，呈球形或类球形。

图3 ASIV 二元醇质体透射电镜图（×50 000）

2.5.2 粒径、PDI和Zeta电位测定 取适量ASIV二元醇质体，纯化水稀释后用纳米粒度及电位分析仪测定其粒径和Zeta 电位，粒径分布见图4。结果表明，ASIV 二元醇质体的平均粒径为（227.07±5.03）nm，PDI 值为（0.172±0.016），说明本品粒径较小且分布均匀；电位值为（-21.06±0.32）mV，说明本品比较稳定，不易聚集。

图4 ASIV 二元醇质体粒径分布图

2.5.3 ASIV二元醇质体稳定性考察 按“2.4.5.4”项下优化的处方制备6 批ASIV 二元醇质体，在4 ℃条件下贮存，分别于第 0、15、30、90 天按“2.3.1”“2.3.2”项下方法测定包封率、平均粒径、Zeta 电位，结果见表9。结果表明，ASIV 二元醇质体在4 ℃条件下稳定性良好。

表9 ASIV 二元醇质体稳定性试验结果（，n=6）

表9 ASIV 二元醇质体稳定性试验结果（，n=6）

时间/d 0 15 30 90包封率/%86.28±0.03 86.37±0.01 86.71±0.02 87.41±0.01粒径/nm 227.07±5.03 229.02±3.84 235.07±6.50 247.47±12.21 Zeta电位/mV 20.03±2.97 21.07±1.64 20.23±1.45 21.90±1.55

3 讨 论

由于二元醇质体体系中保留一定比例的醇相，常用的制备方法为注入法、注入-超声法。注入-超声法因为应用了探头超声，可以减小醇质体的粒径。预试验分别采用注入法、注入-超声法制备ASIV 二元醇质体，结果表明，注入-超声法随着超声时间的增加，醇质体粒径逐渐减小，由220 nm降至137 nm 左右，但包封率也由87%降低至66%，为保证制剂具有较高的包封率，本实验最后选择采用注入法制备ASIV 二元醇质体。

醇相比例对醇质体质量影响较大，一般醇质体中乙醇含量不能＞45%，否则乙醇将溶解并破坏醇质体磷脂囊泡结构［12］。本实验前期对二元醇含量（10%～60%）进行考察，发现二元醇含量在10%～30%时，制备的二元醇质体会产生沉淀，分析原因可能是ASIV 是一种难溶解成分［7］，当处方中二元醇比例较小时，部分ASIV 析出产生沉淀；二元醇含量＞50%时，体系为澄清透明溶液，不能形成醇质体，原因可能是二元醇溶解、破坏了磷脂囊泡结构。所以，本实验进行二元醇质体处方优化时将二元醇与水相的比例确定为4∶6。

二元醇质体的评价指标主要为包封率、平均粒径、PDI 及Zeta 电位，采用星点设计-效应面法优化处方试验中由于各水平条件下二元醇质体的Zeta电位和PDI 值变化不大，所以数据分析时只选择包封率和平均粒径的OD值作为星点设计-响应面法的响应值。结果表明，模型拟合情况良好，响应方程的P值为0.000 2，模型方程极显著，失拟项的P值为0.521 5，失拟项差异不显著，表明实验设计可靠。经验证，优化处方各评价指标的预测值与试验值的偏差均＜4%，可用于ASIV 二元醇质体处方的优化。

综上，本实验通过星点设计-响应面法优化ASIV 二元醇质体处方，建立的响应方程具有良好的预测性，优化所得的二元醇质体处方为：大豆卵磷脂含量3.86%，无水乙醇含量27.13%，丙二醇含量12.87%，水含量60%，制得的ASIV 二元醇质体性质稳定。