阻断粒细胞集落刺激因子受体减轻对乙酰氨基酚引起的小鼠肝损伤的研究

王梦炎，罗灿军，方凌云

对乙酰氨基酚（APAP）是一种用于解热镇痛的安全有效药物，早在1966年就观察到过量可引起急性肝坏死[1]。APAP诱导的氧化应激和线粒体功能障碍被认为是APAP诱导的肝损伤的主要原因，此外氧化应激、APAP代谢、无菌炎症和肝脏修复等也参与了肝损伤的病理生理过程[2]。APAP代谢可导致氧化应激增加，并进一步促进先天免疫细胞（如巨噬细胞和中性粒细胞）的募集和激活。免疫细胞的激活，导致大量促炎细胞因子的分泌。活化的中性粒细胞迁移到肝脏中，并通过释放活性氧、细胞因子、蛋白酶和中性粒细胞胞外陷阱等进一步导致肝损伤加重[3]。粒细胞集落刺激因子受体（G-CSF）是中性粒细胞发育和发挥功能的关键调节因子。GCSF/G-CSFR相互作用与中性粒细胞分化、成熟和释放有关[4]。G-CSF信号传导在急性肝损伤中的作用尚不清楚，但G-CSF信号传导的重要作用已在其他中性粒细胞相关疾病的小鼠模型中得到证实[5]。本研究通过构建APAP诱导的肝损伤小鼠模型，在体内水平研究阻断G-CSFR对肝损伤的影响，报道如下。

1 资料与方法

1.1 动物和试剂C57BL/6小鼠28只，雄性，6～8周，购自宁波大学实验动物中心。普通饲养，建立模型前24 h禁食。

1.2 模型建立及实验分组参照文献建立APAP引起的小鼠肝损伤模型[6]。药物性肝损伤组（APAP组，n=7）小鼠腹腔注射350 mg/kg的APAP（0.7 g APAP溶解于100 ml 0.9%氯化钠注射液中，购自Sigma公司），作用24 h。空白对照组（Sham组）（n=7）腹腔予同等体积的0.9%氯化钠注射液。阻断G-CSFR组（抗G-CSFR组）（n=7）于APAP暴露前24h腹腔注射500 g VR81抗体（购自CSL公司），作用24 h后予APAP溶液。同型抗体对照组（Isotype组）（n=7）小鼠于APAP暴露前24 h腹腔注射500 g VR81同型对照抗体BM4（购自CSL公司），作用24 h后予APAP溶液。各组小鼠样本均在APAP暴露24 h后获取。

1.3 肝功能检测按照丙氨酸氨基转移酶（ALT）及天门冬氨酸氨基转移酶（AST）检测试剂盒（购自南京建成生物工程研究所）说明书操作要求，首先制备上样样本（根据实际情况稀释相应倍数），依次加样与相应试剂，直至最后一步显色，酶标仪下相应波长得到光密度（OD）值，根据换算公式得出ALT及AST的含量。

1.4 肝组织病理学检测在10%多聚甲醛中固定肝组织，依序脱水、包埋、切片、HE染色、封片，光学显微镜下观察肝组织结构并记录保存。

1.5 炎症相关因子的测定根据ELISA检测试剂盒（购自Ebioscience公司）说明书指示，测定血清肿瘤坏死因子（TNF-）及白介素6（IL-6）含量。

1.6 实时荧光定量PCR检测采用Trizol试剂提取肝组织总RNA，用分光光度计测定其浓度并定量。将2.5g总RNA逆转录为cDNA，随后进行SYBR Green实时荧光定量PCR检测IL-6、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、巨噬细胞炎症蛋白2（MIP-2）、补体成分5a受体（C5aR）和C-X-C趋化因子受体（CXCR2）。具体操作步骤按试剂盒（购自TaKaRa公司）说明书进行。所应用的引物见表1。

1.7 Western blot检测凋亡蛋白3（Caspase-3）水平根据蛋白提取试剂盒（购自碧云天公司）说明书，称取质量相近的肝组织，冰上超声匀浆，以4℃、12000g离心力（约12 377 r/min）离心10 min后，取上清液，进行蛋白定量，制作蛋白上样样本。制备12%浓度的SDS-PAGE胶，恒压80 V电泳，250 mA电流电转至偏氟乙烯膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，4℃冰箱孵育一抗（1∶1 000）过夜，第2天室温下与相应二抗（1∶2 000）孵育，TBST洗膜3次，电化学发光试剂显影及曝光。根据图片中条带灰度值检测Caspase-3蛋白相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR检测引物

1.8 统计方法数据采用Prism 9.0软件分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用F检验，多重比较采用SNK-q检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阻断G-CSF受体对APAP引起急性肝损伤肝功能的影响与对照组相比，APAP组小鼠血清ALT及AST水平明显升高（均P＜0.05）；阻断G-CSF受体后，ALT、AST水平较APAP组显著降低（均P＜0.05）。Isotype组ALT及AST变化与APAP组相近（均P＞0.05），见图1。

2.2 阻断G-CSF受体对肝组织病理HE染色的影响对照组镜下可见肝小叶结构完整，肝板排列整齐，肝细胞形态结构正常，未见变性坏死。APAP组镜下可见围绕中央静脉周围的肝细胞微泡性改变，处理24h后肝小叶结构模糊，肝细胞变性坏死、出现大片状坏死灶。抗G-CSFR组肝组织无明显坏死灶，见封二彩图2。

2.3 阻断G-CSF受体对APAP诱导急性肝损伤炎症因子水平的影响APAP组TNF-和IL-6水平均较Sham组明显升高（均P＜0.05）；相较于APAP组，抗G-CSFR组TNF-和IL-6水平均明显下降（均P＜0.05），见图2。

2.4 阻断G-CSF受体减少损伤和炎症相关标志物的表达情况APAP诱导急性肝损伤后，炎症介质IL-6，MCP-1/CCL2和MIP-2/CXCL2的表达，补体/细胞因子受体C5aR和CXCR2的表达均上调（均P＜0.05）。与APAP组相比，阻断G-CSF受体显著减少了上述标志物的增加，与Sham组差异无统计学意义（均P＞0.05），见图3。

2.5 阻断G-CSF受体减少肝细胞凋亡情况APAP组小鼠肝组织中Casepase3表达较Sham组明显增加（P＜0.05）。与APAP组相比，抗G-CSFR组小鼠Casepase 3表达显著下降（P＜0.05），见图4。

3 讨论

中性粒细胞在APAP引起的肝损伤中发挥重要作用，参与肝损伤氧化应激、炎症反应等病理生理过程[3]。G-CSF是中性粒细胞发育和发挥功能的关键调节因子。G-CSF与骨髓祖细胞上的受体G-CSFR结合促进中性粒细胞分化、成熟和释放。此外，G-CSF/GCSFR相互作用促进外周成熟中性粒细胞的存活、活化和运输，并可导致损伤部位的炎症[7]。G-CSF通过激活中性粒细胞并启动中性粒细胞外诱捕来促进炎症部位的损伤已在炎症性关节炎的小鼠模型中得到证实[8]。

本研究结果显示，阻断G-CSFR后，血清中肝损伤标志物ALT及AST均有所降低，细胞因子TNF-和IL-6浓度也下降，肝组织中炎症介质IL-6、MCP-1、MIP-2、C5aR和CXCR2在基因水平表达均有所下调，凋亡相关蛋白Caspase 3表达也减少，肝组织损伤较APAP组减轻。

VR81抗体预先处理减少了APAP引起急性肝损伤后中性粒细胞活化和聚集，减弱了由中性粒细胞介质（如活性氧、蛋白酶和中性粒细胞胞外陷阱）引发的肝细胞和内皮损伤。这反过来又减少趋化因子的表达以及随之而来的巨噬细胞和更多的中性粒细胞的聚集，从而防止损伤的恶性循环并使肝损伤得以恢复。

从安全角度来看，VR81抗体治疗似乎不会减弱细菌或病毒感染小鼠模型的免疫力[9]。此外，一种抗人G-CSFR抗体CSL324被证明在非人灵长类动物中具有良好的耐受性，并且最近已经完成了一期临床研究[8]。因此，阻断G-CSF受体具有潜在的临床应用价值。

综上所述，通过VR81抗体阻断G-CSF受体可以显著降低APAP诱导肝损伤的程度，这提供了一个以G-CSFR为靶点的减轻肝损伤的途径。