扶正化结汤对二乙基亚硝胺诱导的肝细胞癌大鼠炎症反应的影响

赵鹏杰，赵旭，高继良

肝癌是常见的恶性消化系统肿瘤，位居我国癌症发病率第4位[1]。炎症因素在肝癌的发生、发展中扮演重要角色。肝癌归属于中医学“积聚”、“臌胀”、“胁痛”、“黄疸”及“岩”等范畴，“凡属肝病，势必乘土”，可见肝病的治疗中调脾至关重要[2]。杭州市萧山区中医院总结出抗癌经验方扶正化结汤，具有健脾运脾及消瘀化结功效。本文拟探讨扶正化结汤对二乙基亚硝胺（DEN）诱导的肝细胞癌大鼠炎症反应的影响，报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料研究获得浙江中医药大学实验动物管理与伦理委员会审核通过（IACUC-20200824-02）。雄性SPF级WISTAR大鼠30只，体质量150～170g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK（沪）2017-0005。DEN购自美国Sigma公司，货号：N0756-10ML。扶正化结汤颗粒剂，杭州市萧山区中医院中药房提供，主要组成：黄芪15g，白花蛇舌草15g，半枝莲30g，蜂房5g，佛手10g，鸡内金10 g，猫爪草20 g，三叶青5 g，酸枣仁10 g，预知子10g，肿节风30g，茯苓15g，米仁30g。

1.2 分组造模与干预大鼠适应性喂养2周后随机分为3组（n=10）：正常对照组、造模组及中药治疗组。各组均以普通饲料喂养。对照组予以0.9%氯化钠注射液0.4 ml/100 g腹腔注射，1次/周，0.9%氯化钠注射液1ml/100g灌胃，1次/d；造模组予DEN皮下注射50mg·kg-1·次-1，1次/周，0.9%氯化钠注射液1 ml/100 g灌胃，1次/d；中药治疗组予DEN皮下注射50 mg·kg-1·次-1，1次/周，予扶正化结汤1ml/100g灌胃，1次/d，连续17周。

1.3 血清指标检测各组大鼠血清指标检测实验结束后，大鼠腹主动脉采血，用日立3100全自动生化分析仪检测大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平，ELISA法检测白介素6（IL-6）、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、糖类抗原199（CA199）及核转录因子B（NF-B）水平。

1.4 大鼠肝重、体质量、肝脏系数及病理学观察采血后处死大鼠，称体质量及肝脏质量，计算肝重/体质量（肝脏系数）。取肝脏最大叶距肝缘约1 cm的部位切取大小约1cm×1cm×0.3cm组织块，置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于病理学检查。

1.5 肝组织中环氧合酶2（COX-2）及核因子B（NF-B）表达处死大鼠，取一部分肝组织快速置于液氮中，采用实时荧光定量RT-PCR法检测肝组织中COX-2及NF-B表达。

1.6 统计方法数据采用SPSS 20.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用F检验，多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清指标检测比较造模组ALT、AST、IL-6、AFP、CEA、CA199及NF-B水平均高于对照组（t≥3.10，均P＜0.05），中药治疗组上述指标均低于造模组（t≥4.92，均P＜0.05），见表1。

表1 3组间血清指标比较（=10）

2.2 大鼠总体观察、肝重及体质量比较

大鼠饲养过程中，正常对照组大鼠毛色光亮，体型健壮，活动灵活；造模组大鼠毛色晦暗，体型较瘦，活力下降；中药治疗组经治疗后，活力稍有恢复。

与正常对照组相比，造模组大鼠体质量下降（t=9.97，P＜0.01），肝重及肝指数明显上升（t=12.47、25.23，均P＜0.01）。与造模组相比，中药治疗组大鼠体质量与造模组差异无统计学意义（t=0.68，P＞0.05），但肝重及肝指数均明显下降（t=4.01、5.74，均P＜0.01），见表2。

2.3 病理结果病理显示，造模组大鼠肝组织中，纤维组织增多，假小叶形成，肝细胞坏死、变性，偶见癌巢；中药治疗组大鼠的肝组织中，肝细胞坏死及纤维化减少，见封三彩图3。

2.4 COX-2及NF-B表达比较正常对照组、造模组及中药治疗组COX-2表达量分别为1、3.29±1.62及2.29±2.03，造模组表达量高于正常对照组（t=5.30，P＜0.01），中药治疗组表达较模型组低（t=2.31，P＜0.01）。正常对照组、造模组、中药治疗组NF-B表达量分别为2.19±1.06及1.69±0.48，与正常对照组相比，造模组表达量高于正常对照组（t=6.12，P＜0.01），中药治疗组表达较模型组低（t=2.54，P＜0.05）。

3 讨论

研究证实，炎症相关的NF-B在包括肝癌在内的多种恶性肿瘤组织及细胞中表达上调并维持异常激活状态，且和抗肿瘤治疗密切相关，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及复发[3]。静息状态时，NF-B二聚体（p50，p65）与细胞质的抑制因子I B结合，以无活性的状态存在于细胞质中；当细胞内外的各种信号通过级联传导，使I B激酶磷酸化I B仅导致I B降解而NF-B恢复活性的游离状态，激活的NF-B入核与DNA结合，促进下游靶基因转录[4]。

COX-2相关通路可直接调控肿瘤发生发展。有报道显示，卵巢癌细胞中高表达COX-2、分泌PGE2，与其受体结合后可上调NF-B P65的磷酸化水平，增强卵巢癌细胞的增殖能力[5]。高水平的COX-2/PGE2不仅能直接调控肿瘤细胞的恶性生物学行为，还可通过阻碍各种免疫细胞中的促炎反应并介导TME的重编程，使TME处于免疫抑制状态[6]。COX-2还可影响巨噬细胞活化状态。经典活化型巨噬细胞M1和替代活化型巨噬细胞M2分别具有促炎性和抗炎性，NF-B介导巨噬细胞向M1型极化[7]，恢复巨噬细胞的促炎功能，而NF-B又是COX-2的反式激活因子，可增加肿瘤细胞和巨噬细胞中COX-2的表达[8]，二者具有相同的信号分子，COX-2参与调节巨噬细胞向M1型极化。本研究结果显示，扶正化结汤通过调控肝组织中COX-2、NF-B表达水平，对肝癌大鼠炎症反应具有明显的调节作用，与肝脏炎症及坏死相关的ALT、AST、IL-6指标均显著降低，有效降低肝组织纤维化、抑制肝细胞坏死，对肝细胞起到一定的保护作用。

综上所述，扶正化结汤具有控制炎症水平、抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡的作用，其机制可能与下调COX-2及NF-B的表达有关。

表2 3组大鼠体质量、肝重及肝指数比较（=10）