毛细胞白血病和毛细胞白血病变异型患者免疫球蛋白重链可变区基因分子特征分析*

王轶 王婷玉 王君 阎禹廷 吕瑞 熊文婕 邱录贵 易树华

毛细胞白血病（hairy cell leukemia，HCL）和毛细胞白血病变异型（hairy cell leukemia-variant，HCL-v）是两种罕见的慢性B 细胞增殖性疾病（B-cell lymphoproliferative diseases，BLPD），约占整个成人白血病的2%[1]。HCL-v 在过去的很多年中被认为是HCL的一个变种，2016 版世界卫生组织造血与淋巴组织肿瘤分型标准（2016WHO 分型）将其归类于“脾B 细胞淋巴瘤，不能分类”[2]，成为区别于HCL 的一个疾病亚类。由于十分罕见，HCL 和HCL-v 的临床、生物学特征和预后之间的关系尚无明确定论。

这是从入错的角度对责任原因进行排序，还需要从出错的角度对责任原因进行排除，即并非属于责任产生的原因进行排除的缘由。这个方面需要进行充分地论证，而非仅仅只是简单带过，减少并避免说情打招呼的现象导致漏网之鱼的出现。

B 细胞受体（B cell receptors，BCR）及其信号通路激活是B 细胞肿瘤发生和演变过程中关键的分子靶标，其中免疫球蛋白重链可变区（immunoglobulin heavy chain variable region,IGHV）基因的分子特征与B 细胞淋巴瘤的特定临床特征及预后相关。数项基于欧美人群的研究显示，HCL 和HCL-v 对VH3和VH4 基因家族有偏向性使用，而IGHV 未突变状态（IGHV-unmutated，IGHV-UM）和使用VH4-34 片段（VH4-34 rearrangement，VH4-34+）是两种疾病的不良预后因素[3-6]。本研究回顾性分析中国医学科学院血液病医院29 例HCL 和15 例HCL-v 患者IGHV 分子特征及其与临床表现、预后的相关性，旨在探索国内HCL 和HCL-v 患者IGHV 的特征和临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料

研究对象为2004 年12月至2020 年1月在中国医学科学院血液病医院诊疗并完善IGHV 检测的44例患者，其中HCL 为29 例，HCL-v 为15 例。所有患者均完善骨髓/外周血多色流式免疫分型、病理细胞形态及免疫组织化学、靶向测序等多种检测，并由高年资医师根据2016WHO 分型[2]及《B 细胞慢性淋巴增殖性疾病诊断与鉴别诊断中国专家共识（2018 年版）》[7]进行诊断复核。

1.2 方法

1.2.1 IGHV 突变状态及重排片段检测 抽取患者骨髓或外周血标本并提取基因组DNA，按照试剂盒（购于美国InVivoScribe 公司，IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0）说明书对IGHV 基因片段进行多重PCR 技术扩增，随后回收纯化扩增片段并进行双向测序。所得序列与IMGT（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest）和IgBLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast）数据库进行对比以获取突变状态及重排片段信息。IGVH 序列同源性≥98%定义为未发生体细胞突变，同源性＜98%则定义为发生体细胞突变。

44 例患者的中位年龄为54.5（33～86）岁，男女比为3.4∶1。与既往报道相一致，HCL 患者发病年龄更轻且男性患者更为多见、血细胞减少表现更为明显，而HCL-v 患者更易出现乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和β2 微球蛋白（β2microglobulin，β2-MG）水平升高、脾大及核型异常（表1）。治疗方面，28 例HCL 患者和14 例HCL-v 患者具备治疗指征。超过70%患者一线接受核苷类似物联合或不联合利妥昔单抗治疗，5 例HCL 患者和2 例HCL-v 患者接受干扰素治疗，1 例HCL 患者和2 例HCL-v 患者采用瘤可燃或中药治疗，2 例HCL 患者于药物治疗前接受切脾治疗。

1.2.2 随访 通过门诊、住院病历资料及电话进行随访。对随访期间死亡的病例，根据病历记录或与患者家属电话联系确认。随访时间截至2021 年5月，中位随访时间36（5～188）个月。总生存时间（overall survival，OS）为治疗开始至因任何原因所致的死亡时间或末次随访时间。无进展生存时间（progressionfree survival，PFS）定义为治疗开始至疾病复发/进展、任何原因导致的死亡或末次随访时间。

将HCL 患者按照VH 基因分为VH1、VH3 和VH4 3 组，发现使用VH4 基因的患者出现中性粒细胞减少的比例偏低（ VH1vs.VH3vs.VH4 为100.0%vs.88.9%vs.50.0%，χ2=5.370，P=0.070），而使用VH1基因的患者则更少发生脾肿大（VH1vs.VH3vs.VH4为50.0%vs.100.0%vs.90.0%，χ2=5.560，P=0.041）。以重排片段是否为VH4-34 对HCL 患者进行分组，VH4-34+的HCL 患者LDH（VH4-34+vs.VH4-34-为205.2 U/Lvs.160.5 U/L，t=2.063，P=0.049）及β2-MG（VH4-34+vs.VH4-34-为4.45 mg/Lvs.2.20 mg/L，U=3.000，P=0.039）水平更高。进一步以IGHV 突变状态对患者进行分组，未突变的HCL 患者也表现为更高肿瘤负荷特征，具有更高的LDH（IGHV-UMvs.IGHV-M 为197.2 U/Lvs,.155.3 U/L，t=2.440，P=0.022）及β2-MG（IGHV-UMvs,.IGHV-M 为3.71 mg/Lvs,.2.11 mg/L，U=5.000，P=0.036）水平。25 例HCL患者通过Sanger 测序或二代测序对BRAF V600E 基因突变进行检测，其突变阳性率为72.0%（18/25）。VH4-34+患者BRAF V600E 突变率明显低于VH4-34-患者［20.0%（1/5）vs.85.0%（17/20），P=0.012］。

1.3 统计学分析

HCL-v 患者的年龄分布、血细胞计数、血红蛋白（hemoglobin，Hb）水平、生化指标（LDH、β2-MG 等）、脾肿大、B 症状等在以常见VH 家族基因、是否使用VH4-34 片段或IGHV 突变状态为分组依据的亚组中无明显差异。

2 结果

2.1 患者基线及治疗资料

据自然正家的数据统计，在服务过程中换用公司自发研制的清洁套组后，员工的工作效率提升了17%，客户满意率达到98%以上。好品质的清洁套组和高口碑的服务在客户群中口口相传，公司的订单也就越来越多。

表1 基线特征及治疗情况

2.2 VH 基因使用情况和突变状态

44 例患者均检测出重排，共涉及23 种重排片段。HCL 和HCL-v 的VH 基因使用存在明显的偏向性和相似性（图1A）。7 个VH 基因家族中，VH4、VH3、VH1 基因依次为两种疾病最常使用的3 种基因，86.2%（25/29）的HCL 患者和93.3%（14/15）的 HCL-v患者均集中于这3 种基因。具体到VH 基因片段（图1B），HCL 最常见的两种重排片段为VH4-34（17.2%）和VH3-23（10.3%）；HCL-v 最常见的两种重排类型则为VH4-34（20.0%）和VH4-39（13.3%）。

IGHV 基因为突变状态（IGHV-mutated，IGHV-M）的患者在HCL 和HCL-v 中分别占72.4%（21/29）和66.7%（10/15），中位突变值分别为3.8（0～13.2）%和4.1（0～12.0）%。不同VH 基因家族的突变率呈不均一分布（图1A），使用VH4 基因的患者中，50%的HCL 患者和60% 的患者为IGHV-UM，突变率显著低于其他基因家族（P=0.032）。对常见VH 基因片段的分析显示，VH4-34 在HCL 和HCL-v 中的突变率分别为20%（1/5）和0（0/3），明显低于其他基因片段（P＜0.001）。

图1 IGHV 基因家族和常见重排片段的分布情况

2.3 IGHV 分子特征与临床特征相关性

目前，奶牛场常用消毒液有碘伏、次氯酸钠和新洁尔灭等[15]，均需用水稀释后使用，药浴后蒸发较快，作用持续时间短，易造成乳房的重复感染，且对奶牛皮肤有一定的刺激和影响[16]。其中聚维酮碘是由聚乙烯毗咯烷酮与碘结合形成的一种无定形复合物，对皮肤有比较好的湿润和保护作用，因此广泛应用于奶牛场的乳头消毒。但碘制剂消毒液有一定的残留作用，Bogdan等人发现，碘消毒和乳房乳头药浴将增加平均牛奶碘含量从（44±1.6）～（59.3±2.3）μg/1000 mL[3]。

VH4-34+克隆性B 细胞可见于多种淋巴瘤及自身免疫病。据文献报道，约 5%的正常B 细胞为VH4-34+，而其在多发性骨髓瘤、CLL、滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）、套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）和弥漫性大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）的使用率分别为0、4%～22%、9%～23%、11%～16% 和15%～65%，即整体上侵袭性淋巴瘤中VH4-34 的使用率更高[10,13-16]。而针对多种淋巴瘤亚型的分子病理学研究显示，特定的IGHV 分子特征对应特定的遗传学异常及信号通路活性改变，如VH4-34+眼附属器黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤TNFAIP3 突变率更高[17]，而VH4-34+FL 则与低IGH/BCL2 易位率相关[13]。BRAF V600E 突变是HCL 发生发展早期出现的重要驱动性遗传学事件[1]。同前期研究相一致[18]，本研究证实VH4-34+HCL 患者BRAF V600E 突变阴性率更高。基于中国HCL 患者更高的VH4-34 使用率，另一项国内HCL患者特征研究[19]所显示的较低BRAF V600E 突变率也一定程度上支持中国与欧美HCL 患者间存在病理生理学差异。

采用SPSS 26.0 软件进行统计学分析。分类变量组间比较采用χ2检验或Fisher 精确概率法，计量资料的组间比较采用t检验或Mann-Whitney 非参数检验。采用Kaplan-Meier 法计算PFS 和OS 并绘制生存曲线，单因素分析采用Log-rank 检验。双侧检验以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2.4 IGHV 分子特征的预后意义

38 例患者于本院接受系统治疗并具备随访信息（HCL 25 例，HCL-v 13 例）。中位随访时间36（5～188）个月，HCL 患者的PFS 明显长于HCL-v 患者[3年PFS 率HCLvs.HCL-v 为（90.2±6.6）%vs.（60.0±16.7）%，P=0.042]，OS 无显著性差异［3 年OS 率HCLvs.HCL-v 为（100.0±0）%vs.（90.0±9.5）%，P=0.224；图2A～B］。对可能影响预后的因素进行单因素分析，LDH 水平升高（PFSP＜0.001，OSP=0.025）和VH4-34+（PFSP=0.001，OSP=0.004；图2C ～D）的HCL 患者PFS 和OS 更短；Hb＜100 g/L（P=0.023）、脾 大（P=0.025）和IGHV-UM（P=0.038，图2E）为HCL-v 患者PFS 的不良预后因素，IGHV-UM 的HCLv 患者OS 也有缩短趋势（P=0.060，图2F）。白细胞增多、淋巴细胞增多、血小板减少、β2-MG 水平升高、复杂核型、确诊时外周血/骨髓流式细胞比例在本研究中未显示出明显预后意义。

图2 患者生存曲线

3 讨论

本研究对近15 年来本院收治的HCL 和HCL-v患者的IGHV 分子特征进行回顾性分析。与国外报道相一致，国内HCL 和HCL-v 患者最常见的VH 基因家族集中于VH4、VH3 和VH1，这也与正常B 细胞和多种BLPD 的VH 基因家族分布大致相似。但相较于两项美国研究[3，5]中HCL 对VH3（57%）和VH3-23（21%）的偏向性使用，本队列中HCL 患者VH4（34.5%）及VH4-34（17.2%）的使用比例明显增高。事实上，在既往本课题组和其他团队的研究中，VH4基因家族（尤其是VH4-34）在国内BLPD 患者中的使用比例较欧美国家更高，其在慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）、淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤等多种BLPD中的使用率均居首位或前3 位[10-12]。该现象或可反映种族及环境中特定的抗原选择过程，提示中西方疾病差异的潜在机制。

B 细胞在发育成熟过程中会先后经历IGHV 重排、体细胞高频突变和类别转换等过程，最终获得具有多样性和高抗体亲和性的BCR。BCR 可识别抗原参与免疫反应，其信号通路活化也是B 细胞肿瘤发生发展和克隆演变的驱动因素。每个B 细胞均具备特定的BCR 特征。因此，IGHV 使用片段和突变状态能够反映B 细胞的来源和生物特征，目前已用于阐释多种自身免疫病、B 细胞肿瘤的病理机制或应用于诊断、预后评估或微小残留病监测等[8-9]。既往较少研究关注HCL 和HCL-v 的IGHV 分子特征。作为两种非常罕见的BLPD，国内患者的IGHV 基因分布、突变状态及其与临床特征、预后的关系有待进一步探索。

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基于欧美人群的研究[3,5]显示，VH4-34+HCL 患者具备独特的临床特征，如初诊时高白细胞数、低IGHV 突变率等。在本队列中，VH4-34+HCL 也表现出高LDH 和β2-MG 水平等高肿瘤负荷特征，并与IGHV-UM 相关。事实上，VH4-34+肿瘤细胞在不同淋巴瘤中的IGHV 突变率也不尽相同。一项中国多中心CLL 患者IGHV 特征的研究[10]显示，VH4-34+与高IGHV 突变率相关（P=0.001）。而本研究所显示的VH4-34+在HCL 和HCL-v 患者中有更高未突变率（P＜0.001）与既往研究一致[3,5]。即综合IGHV 片段使用和突变信息能够提供更丰富的肿瘤细胞起源和演进信息，有助于加深对特定组群患者疾病特征的理解。

IGHV 特征也是淋巴瘤的重要预后因素。目前，IGHV-UM 已在CLL、MCL 和DLBCL 等淋巴瘤中均被证实是不良预后因素[8,16,20]。而特定片段使用也与预后相关，如使用VH3-21 的突变型CLL 患者预后并未优于未突变型CLL 患者等[21]。本研究中，VH4-34+和IGHV-UM 分别是HCL 和HCL-v 的不良预后因素。受限于病例数，本研究未进一步行多因素预后分析确定这两种疾病的独立预后因素。考虑到VH4-34+HCL 对克拉屈滨单药不敏感及免疫化疗在这两种疾病中的有效性[3,22]，临床上对VH4-34+HCL 患者宜首选核苷类似物联合利妥昔单抗治疗，未来也应继续探索更优治疗策略。

由于疾病的罕见性，前期和本研究的部分发现仍有待更深入的探究。如VH4-34+HCL 所显现的高肿瘤负荷、特定基因突变谱以及更差预后与VH4-34+HCL-v 存在明显一致性，共同反映了VH4-34+肿瘤细胞的特殊起源及肿瘤演进过程。对于这类临床表现、病理形态和免疫表型相似的淋巴瘤亚型，依据分子分型的诊疗模式或许优于疾病分型，而该观点的合理性还有赖于更多多组学研究的证据支持。此外，VH4-34+和IGHV-UM 均被认为是HCL 和HCL-v的不良预后因素，而考虑到两者的高度共现性，特定基因片段和IGHV 突变状态的独立预后意义有待被证实。

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综上所述，本研究显示中国HCL 和HCL-v 患者对VH4 基因家族，尤其是VH4-34 存在使用偏向性，而这类患者更易为IGHV-UM。VH4-34+HCL 患者具有更高肿瘤负荷、更低BRAF V600E 突变的特征。同时，IGHV 的分子特征与HCL 和HCL-v 患者不同预后相关。