豆渣水溶性膳食纤维的复合酶法提取及其应用于可食性膜研究

皮小弟，罗瑞婷，李叶青,,*，邹志群,3，吴思毅，黄志远

（1.广东江门中医药职业学院南药学院，广东 江门529000；2.河源职业技术学院机电工程学院，广东 河源517000；3.肇庆学院食品与制药工程学院，广东 肇庆526061）

大豆在我国食用广泛，绝大部分用于榨油或加工成豆制品，如腐竹、豆腐、豆乳等，在生产过程中会产生大量的副产物——豆渣。豆渣富含蛋白质、膳食纤维、脂肪、氨基酸、维生素等[1-2]，具有较高的利用价值。目前对豆渣的研究利用主要包括以下两个方面：一是直接利用，以替代部分食品原料，如制作馒头[3-4]、面包[5-6]、饼干[7]、蛋糕[8]和饮料[9]等食品；二是有效成分的提取和利用，主要是膳食纤维，包括水溶性膳食纤维（Soluble dietary fiber，SDF）和水不溶性膳食纤维。豆渣总膳食纤维约占豆渣干物质的65%[10]，但大多为水不溶性膳食纤维，SDF含量低限制了豆渣在食品工业中的应用[11]。SDF在水溶液中只有形成凝胶网络结构才能吸附重金属离子或胆汁酸等小分子物质，发挥一系列生理功能[12-13]。为提高SDF的提取量，有研究采取了一系列辅助提取方法，主要有：挤压膨化[14]、超高压均质[15]、超声[16]等物理法；酸[17]、碱[18-19]处理等化学法；酶法[20]、微生物发酵法[21-23]等生物法；其他复合方法[24-27]。可食膜是指由可食性材料形成的膜，其可通过防止气体、水汽和溶质的迁移来保证食品的质量，延长食品的货架期[28]。目前，可食性膜的研究按照原料来源一般可分为以下几类：以碳水化合物类为基础的可食性膜[29-33]、以蛋白质类为基础的可食性膜[34-36]、以类脂类为基础的可食性膜和复合型可食性膜[37]。也有利用豆渣制备可食性包装纸的研究报道。昆明理工大学[38]授权了一种用豆腐渣制备膳食纤维可食用包装纸的发明专利；任媛媛等[39]探讨了豆渣可食用包装纸制备的最佳配方，但在豆渣可食性膜的研究上鲜有报道。本文以豆渣为原料，对其进行干燥后采用复合酶法进行酶解，明显提高了豆渣中SDF的提取率。在提取的基础上进行豆渣可食性膜性能的初步研究，得到一种光滑且性质稳定的豆渣可食性膜。利用豆渣中的SDF生产可食性膜，进而用其生产包装纸，不仅可以提高废弃物的利用率，还能减少对环境的污染[40]，开发前景十分广阔。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

豆渣：河源市美芳源食品有限公司。

纤维素酶（1 000 U/g）、碱性蛋白酶（20 000 U/g），青岛蔚蓝生物股份有限公司；碳酸氢钠、无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、海藻酸钠、甘油，西安惠邦生物工程有限公司。以上试剂均分析纯。

1.1.2 仪器与设备

DHG-9243A鼓风干燥箱，上海精其仪器有限公司；HL-PHJ-30单相微型膨化机，山东鸿朗机械设备有限公司；XY-SYG-16恒温水浴锅，上海昕仪仪器仪表有限公司；L420台式低速自动平衡离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；FD-1B-50真空冷冻干燥机，上海豫明仪器有限公司；摇摆式粉碎机，永康市荣舒五金机械有限公司；HS-12磁力搅拌器，群安实验仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 豆渣的处理

将豆渣于铁盘上摊成薄层，置于65℃鼓风干燥箱中干燥烘制，每1 h翻面1次，直至豆渣不能捏成团。烘制过的豆渣经过膨化机处理，粉碎，得到处理好的豆渣样品。

1.2.2 豆渣SDF提取工艺流程

称取一定质量的豆渣样品（精确到0.000 1 g）→按比例加入蒸馏水→添加纤维素酶（按蒸馏水添加量的体积计）→磁力搅拌酶解（45℃）→加热灭酶（100℃，10 min）→调pH值→添加碱性蛋白酶（豆渣样品质量的1%）→60℃磁力搅拌酶解30 min→加热灭酶（100℃，10 min）→过滤→滤液中加入无水乙醇（滤液体积的4倍），沉淀过夜→离心（4 000 r/min，15 min）→对沉淀进行真空冷冻干燥→豆渣SDF干品

1.2.3 豆渣SDF提取工艺的优化

1.2.3.1 单因素试验设计

按照“1.2.2”所示方法提取豆渣SDF，研究豆渣与蒸馏水之比（料液比）、纤维素酶添加量、酶解时间、蛋白酶酶解体系pH值对SDF提取率的影响。

固定纤维素酶添加量为1%，酶解时间为2.0 h，蛋白酶酶解体系pH值为9，研究料液比分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL）时豆渣SDF的提取率；固定料液比为其优化值，酶解时间为2.0 h，蛋白酶酶解体系pH值为9，研究纤维素酶添加量分别为1%、2%、3%、4%时豆渣SDF的提取率；固定料液比、纤维素酶添加量为其优化值，蛋白酶酶解体系pH值为9，研究酶解时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h时豆渣SDF的提取率；固定料液比、纤维素酶添加量、酶解时间为其优化值，研究蛋白酶酶解体系pH值分别为8、9、10、11时豆渣SDF的提取率。

1.2.3.2 正交试验设计

在单因素试验基础上，选择料液比、纤维素酶添加量、蛋白酶酶解体系pH值为主要影响因素，以SDF提取率为考察指标，采用L9(34)正交试验，对豆渣SDF提取工艺进行优化。正交试验因素水平见表1。

表1 豆渣SDF提取工艺优化正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table for soybean residue SDF extraction optimization

1.2.4 豆渣SDF可食性膜的制备

将按照最优工艺制备得到的豆渣SDF干品，以料液比1∶10（g∶mL）的比例加入蒸馏水，得到豆渣SDF水溶液；在SDF水溶液中加入一定量的CMC-Na、海藻酸钠，磁力搅拌混合均匀；再加入甘油，磁力搅拌混合均匀；用玻璃棒将混合溶液涂于表面光滑并已预热的玻璃上，65℃干燥至恒重；然后将膜置于20℃、相对湿度90%的恒温恒湿培养箱中15 min，得到成品。

1.2.5 豆渣SDF可食性膜制备条件的优化

1.2.5.1 单因素试验设计

按照“1.2.4”的方法制备豆渣SDF可食性膜，研究CMC-Na、海藻酸钠、甘油添加量对豆渣SDF可食性膜性能的影响。

称取1 g豆渣SDF干品制成水溶液，固定CMCNa添加量为1 g，海藻酸钠添加量为1 g，研究甘油添加量分别为1.5、3.0、4.5、6.0 mL时对豆渣SDF可食性膜水溶性和透水性的影响；固定甘油添加量为其优化值，CMC-Na添加量为1 g的条件下，研究海藻酸钠添加量分别为0.5、1.0、1.5、2.0 g时对豆渣SDF可食性膜水溶性和透水性的影响；固定甘油添加量、海藻酸钠添加量为其优化值，研究CMC-Na添加量分别为0.5、1.0、1.5、2.0 g时对豆渣SDF可食性膜水溶性和透水性的影响。

1.2.5.2 正交试验设计

在单因素试验结果基础上，选择CMC-Na、海藻酸钠、甘油添加量为主要影响因素，以豆渣SDF可食性膜水溶解速度和水滴漏时间为考察指标，采用L9(34)正交试验，对豆渣SDF可食性膜制备工艺进行优化。正交试验因素水平见表2。

表2 SDF可食性膜制备条件优化正交试验因素水平表Table 2 Orthogonal factor level table for preparation conditions optimization of SDF edible film

1.2.6 测定项目与方法

1.2.6.1 豆渣SDF提取率

计算公式为：

式中：m0为豆渣样品质量，g；m1为由豆渣样品提取的SDF质量，g。

1.2.6.2 膜水溶性测定

参照李佩燚等[41]的方法，稍作修改。称取一定量的豆渣SDF可食性膜（精确到0.000 1 g）放入30℃、100 mL蒸馏水中，快速搅拌至溶液中无碎片为止，按下式计算豆渣SDF可食性膜水溶解速度。膜水溶性以水溶解速度表示，水溶解速度越大，表示膜水溶性越好。

式中：m2为豆渣SDF可食性膜质量，g；t1为豆渣SDF可食性膜水溶解时间，s。

1.2.6.3 膜透水性测定

参照李佩燚等[41]的方法，稍作修改。将豆渣SDF可食性膜覆盖于烧杯口上，在纸膜上用胶头滴管滴加水2滴后开始计时，到纸膜下有第一滴水滴下终止，所记录的时间为豆渣SDF可食性膜水滴漏时间（单位为s），以水滴漏时间判断膜透水性，水滴漏时间越短，膜透水性越好，阻水能力越差。

1.2.7 数据处理

采用WPS Office软件进行数据分析并作图。

2 结果与分析

2.1 豆渣SDF提取单因素试验结果

由图1可知，料液比对豆渣SDF的提取率有较大的影响，这主要是因为料液比会影响豆渣提取水溶液的黏度和浓度，当料液比为1∶15（g∶mL）时，溶液黏度较大，影响豆渣SDF的溶出，而酶解作用无法达到最佳状态，提取率较低；当蒸馏水添加比例逐渐升高时，由于水溶液体积增大，与豆渣SDF所形成的浓度差变大，豆渣SDF的溶解扩散速度加快，同时酶的催化作用加强，豆渣SDF提取率明显升高。当豆渣SDF的溶出达到平衡时，豆渣中SDF溶出较彻底，此后由于水解产物单糖的产生使得豆渣SDF提取率开始降低。当料液比为1∶20（g∶mL）时，SDF提取率达到峰值，表明在该料液比条件下酶解效果最好，豆渣SDF提取率最高。

图1 料液比对豆渣SDF提取率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on SDF extraction rate

由图2可知，随着纤维素酶添加量的增加，豆渣SDF提取率也随之升高，呈现出先快速上升后趋于平缓的趋势。当纤维素酶添加量过大时，豆渣SDF会被酶解为单糖，同时由于酶活性的降低，致使SDF提取率呈小幅度下降并趋向于平稳。故选择纤维素酶添加量2%为最适添加量。

图2 纤维素酶添加量对豆渣SDF提取率的影响Fig.2 Effect of cellulase addition on SDF extraction rate

一般情况下，在一定时间内豆渣酶解时间越长，酶解效果越好，豆渣SDF提取率也就越高。由图3可知，当酶解时间达到2 h时，豆渣SDF提取率最高，之后开始下降，主要原因可能是酶解过度，豆渣SDF转变成了单糖等可溶性糖。因此选择最佳酶解时间为2 h。

图3 纤维素酶酶解时间对豆渣SDF提取率的影响Fig.3 Effect of cellulase hydrolysis time on SDF extraction rate

本试验使用的是碱性蛋白酶，故需将其酶解体系调成碱性状态，pH值的改变会影响酶活性中心的构象，从而影响酶对底物分子的结合和催化，只有在最佳pH值条件下才最适宜酶和豆渣SDF的相互结合，使酶充分发挥催化作用，进而使豆渣SDF提取率达到最高，但pH值过大会使酶变性失活，导致酶的催化效果降低。由图4可知，当蛋白酶酶解体系pH值为9时，碱性蛋白酶对豆渣催化作用达到最好，豆渣SDF提取率达到最高。

图4 蛋白酶酶解体系pH值对豆渣SDF提取率的影响Fig.4 Effect of protease enzymolysis pH on SDF extraction rate

2.2 豆渣SDF提取正交试验结果

豆渣SDF提取工艺正交试验结果见表3。

表3 豆渣SDF提取工艺优化正交试验结果Table 3 Orthogonal experimental results of SDF extraction

由表3可以看出，各因素对豆渣SDF提取率大小的影响顺序为：料液比（A）＞蛋白酶酶解体系pH值（C）＞纤维素酶添加量（B），最佳组合为A3B3C2，即料液比1∶30（g∶mL），纤维素酶添加量3%，蛋白酶酶解体系pH值为9，该组合和正交试验表中的最佳组合相同，提取率为23.74%。

2.3 豆渣SDF可食性膜制备单因素试验结果

由图5可以看出，甘油添加量对豆渣SDF可食性膜的水溶性和透水性的影响大小不同。随着甘油添加量的增加，膜的水溶解速度变化不大，即膜水溶性变化不大，呈稍减小的趋势，说明其在水中溶解的速度仅略有降低。随着甘油添加量的增加，膜的水滴漏时间明显减少，表明其阻水能力明显降低。膜的透水性强弱体现了其保水阻水能力的强弱，一般情况下水滴漏时间较长为好。综合数据分析可得，试验条件下，为制备阻水能力较好的豆渣SDF可食性膜，甘油添加量选择1.5 mL为宜。

图5 甘油添加量与豆渣SDF可食性膜性能的关系Fig.5 Relationship between glycerol addition and properties of SDF edible membrane

由图6可以看出，随着海藻酸钠添加量的增加，膜的水溶解速度逐渐变小，但变化幅度不大，而水滴漏时间明显增加，这是由于海藻酸钠不但对膜液能起到稳定、乳化的作用，而且还对膜起到辅助构架的作用。海藻酸钠添加量为1.5 g时，豆渣SDF可食性膜的阻水性能较好。综合比较，选择1.5 g作为海藻酸钠最适添加量。

图6 海藻酸钠添加量与豆渣SDF可食性膜性能的关系Fig.6 Relationship between sodium alginate dosage and properties of SDF edible membrane

由图7可以看出，随着CMC-Na添加量的增加，膜的水溶解速度初期降低较快，中、后期变化较小；水滴漏时间呈明显增加的趋势。这是因为在一定湿度下，CMC-Na的黏度和高分子量可以赋予膜较高的强度和韧性，使得膜的水溶性变差，保水性增强。综合考虑，选择CMC-Na添加量2.0 g为最适添加量。

图7 CMC-Na添加量与SDF可食膜性能的关系Fig.7 Relationship between CMC-Na addition and SDF edible film performance

2.4 豆渣SDF可食膜制备工艺正交试验优化结果

豆渣SDF可食膜制备工艺正交试验优化结果结果见表4。

表4 SDF可食膜制备条件正交优化试验结果Table 4 Orthogonal test results of SDF edible film preparation conditions optimization

由表4可知，影响豆渣SDF可食性膜水溶性大小的因素排序为：A（甘油添加量）＞B（CMC-Na添加量）=C（海藻酸钠添加量）；影响豆渣SDF可食性膜透水性大小的因素排序为：C（海藻酸钠添加量）＞B（CMC-Na添加量）＞A（甘油添加量）。由使用条件来看，可食性膜需要有一定的水溶性，但其阻水性能更为重要，因此确定试验条件下成膜最佳因素组合为A2B2C3，即：CMC-Na添加量1.0 g，海藻酸钠添加量1.5 g，甘油添加量4.5 mL。该组合和正交试验表中的最佳组合相同，利用该组合制备的豆渣SDF可食性膜，水滴漏时间为12 060 s。

3 结论

本试验首先研究豆渣SDF提取的最佳工艺，然后在此基础上对豆渣SDF可食性膜成膜条件进行了优化。结果表明，豆渣SDF提取的最佳工艺为：料液比1∶30（g∶mL），纤维素酶添加量3%，酶解时间2 h，蛋白酶酶解体系pH值为9；豆渣SDF可食性膜成膜最佳条件为：1.0 g豆渣SDF添加海藻酸钠1.5 g，CMC-Na 1.0 g，甘油4.5 mL。在优化条件下制备的豆渣SDF可食性膜光滑、性质稳定，水溶解速度为0.098 mg/s，水滴漏时间为12 060 s。本试验为豆渣SDF可食性膜的研制提供了一定的参考依据。今后将对豆渣SDF的组成结构以及成膜性能做进一步的研究。