复合香辛料提取物对冷藏猪肉糜氧化及品质特性的影响

邹欣洋，计 瑶，张 晶，陈 钰，孙 晶

（锦州医科大学食品与健康学院，辽宁 锦州121001）

肉糜制品因其营养丰富和食用方便深受消费者的喜爱[1]，但在加工储藏过程中易发生氧化，不仅影响其食用品质，还会缩短货架期[2-3]。脂肪氧化会严重影响肉制品风味，蛋白质氧化则会导致其保水性和嫩度下降[4]，降低其凝胶乳化性能，从而最终影响加工制品品质[5-6]。为了减缓氧化对其品质的影响，可向肉制品中添加人工合成抗氧化剂或天然抗氧化剂。目前肉制品生产中常用的人工合成抗氧化剂有二丁基羟基甲苯（Butylated hydroxytoluene,BHT）和丁基羟基茴香醚（Butyl hydroxyanisole,BHA）等。此类抗氧化剂虽然有较好的抗氧化性，但也存在一定的毒副作用，长期摄入会对人体健康带来潜在危害[7]。近年来，香辛料等天然植物抗氧化剂逐渐替代化学合成抗氧化剂被应用到食品中，具有成分安全、价格低廉、绿色天然等优点。

天然香辛料中的抗氧化成分主要为多酚类化合物及其衍生物、黄酮类、萜稀类化合物等[8]。添加香辛料不仅能起到抗氧化的效果，还可赋予肉制品特定的风味，抑制其微生物生长。桂皮（Cinnamomum tamala(Ham.)Nees et Eberm.），又称官桂或香桂，樟树科樟属植物[9]，作为烹饪调料和中药材使用已有几千年的历史，其抗氧化成分主要有桂皮酚、桂皮醛、查尔酮和肉桂醇等[10-11]。生姜（Zingiber officinale Rosc.），姜科植物的根茎，为常见的药食同源香辛料。生姜中的化学成分复杂，其中姜辣素、姜酚、姜酮和活性多糖等成分抗氧化效果显著[12-13]。八角茴香（Illicium verum）为木兰科八角属的干果，又称大茴香、大料。有研究证实八角茴香的体外抗氧化能力与BHA等抗氧化剂相当，可显著抑制食品中常见污染菌如蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的生长[14]，是一种兼具抑菌和抗氧化作用的天然香辛料[15]。本研究将桂皮、生姜、八角茴香提取物按照一定比例复配后添加至冷藏猪肉糜中，测定其硫代巴比妥酸值（TBARS）、总巯基、羰基、pH、蒸煮损失、色差、质构特性等指标，并观察其微观结构的变化，探究复合香辛料提取物对冷藏猪肉糜脂肪和蛋白氧化的抑制效果及对品质的影响，以期为复合香辛料提取物在肉制品加工中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

猪背最长肌、肥膘及食盐购于锦州市大润发超市；生姜、桂皮、八角茴香提取物，购于西安百川生物科技有限公司；纤维素酶（30 000 U/g）、没食子酸标准品，购于上海惠世生化试剂有限公司；丁基羟基茴香醚（BHA）、焦磷酸钠（食品级）、乙二胺四乙酸二钠、2-硫代巴比妥酸（TBA)、三氯乙酸（TCA），均购于上海阿拉丁试剂有限公司；氯化钠、氯化镁、尿素、十二烷基硫酸钠（SDS）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、盐酸、牛血清蛋白、5,5’-二硫双(2-硝基苯甲酸）（DTNB）、2,4-二硝基苯肼（DNPH）、乙酸乙酯、无水乙醇、盐酸胍、戊二醛，均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

FZ102型微型植物粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；KH-500V型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；S18-LA170碎肉机，山东九阳小家电有限公司；BCD-180LLC2E0C9海尔冰箱，青岛海尔有限公司；SHA-B水浴恒温振荡器，金坛市科系仪器有限公司；UV-5100B紫外分光光度仪，上海元析仪器有限公司；TENLIN-C均质器，江苏天翎仪器有限公司；GL-21M高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；FA1004电子分析天平，浙江天晟电子有限公司；PHS-25数显pH计，上海越平科学仪器制造有限公司；CR-400便携式色差仪，日本Konica Minolta公司；TMS-PRO质构仪，北京盈盛恒泰科技有限责任公司；FreeZone真空冷冻干燥机，美国LABCONCO公司；SIGMA500扫描电镜，德国蔡司公司。

1.2 方法

1.2.1 香辛料提取物比例的筛选

参照杜方丽等[16]的方法并作修改，基本配方为：猪背最长肌70%，肥膘10%，NaCl 2%，0.25%焦磷酸钠（Sodium pyrophosphate，TSPP），去离子水7.75%，不同浓度香辛料提取物溶液10%（空白对照组用去离子水代替香辛料提取物，阳性对照用0.02%BHA代替香辛料提取物）。

将猪肉绞成肉糜后，按比例分为6个处理组：第1组为空白对照组；第2组添加0.02%BHA作阳性对照；第3～6组固定香辛料提取物溶液浓度为0.5%，分别按照桂皮∶生姜∶八角茴香（质量比）为1∶1∶1、2∶1∶1、2∶2∶1、1∶2∶1的比例添加香辛料提取物。混匀后，将肉糜分别放入包装盒中，用保鲜膜封好，置于4℃冰箱冷藏，分别在第1、3、5、7天测定其硫代巴比妥酸值，确定香辛料提取物比例。

1.2.2 猪肉糜的制备及预处理

基本配方同“1.2.1”。将猪肉绞成肉糜后，按比例分为5个处理组：空白对照为基础物质（猪肉糜、2%NaCl、0.25%TSPP、去离子水7.75%）+去离子水10%；0.02%BHA组为基础物质+0.02%BHA；处理1～3分别为基础物质中加入0.3%（处理1）、0.7%（处理2）、1.1%（处理3）浓度的香辛料提取物溶液（桂皮∶生姜∶八角茴香质量比为2∶2∶1）。混匀后，将猪肉糜分别装入包装盒中，用保鲜膜密封后，置于4℃冰箱冷藏，分别在第1、3、5、7天测定各项指标。

1.2.3 测定项目与方法

1.2.3.1 脂肪氧化分析

TBARS值：参照GB 5009.181—2016[17]中的方法进行测定。

1.2.3.2 蛋白质氧化分析

肌原纤维蛋白（MP）的提取：参照Park等[18]的方法，称取适量的肉糜样品加入其4倍体积的4℃提取液，匀浆60 s，3 500 r/min条件下冷冻离心15 min。取沉淀重复匀浆离心两次，去上清，所得沉淀用4倍体积4℃洗液重复清洗3次，4层纱布过滤，并用HCl调节pH值至6.0，将得到的沉淀置于密闭的瓶中在4℃下保存备用，需在24 h内使用。

总巯基含量的测定：参照Yang等[19]的方法。将提取的MP溶液用0.1 mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.4）稀释为质量浓度2 mg/mL。准确吸取0.5 mL的MP溶液于试管中，先后加入2.0 mL尿素-SDS溶液和0.5 mL DTNB溶液，混匀后，置于暗处反应30 min，于波长412 nm处测定吸光度值。计算公式为：

式中：巯基含量的单位用质量摩尔浓度（nmol/mg）表示；A表示412 nm波长处的吸光度值；C表示蛋白质质量浓度（mg/mL）；106为摩尔基础单位；13 600 mol/（L·cm）为摩尔吸光系数。

羰基含量的测定：吸取1 mL质量浓度为2 mg/mL的MP溶液置于塑料离心管中，再加入1 mL浓度为0.01 mol/L的DNPH溶液，避光反应40 min，每隔10 min旋涡振荡1次，加入1 mL TCA溶液，10 000 r/min离心6 min，弃上清，沉淀用1 mL乙醇-乙酸乙酯（1∶1）溶液清洗3次，除去未反应的DNPH试剂，加入6 mol/L的盐酸胍溶液3 mL，于38℃水浴条件下反应15 min以溶解沉淀，在4℃、10 000 r/min再次离心3 min，于波长370 nm处测量吸光度值[20]。计算公式为：

式中：羰基含量的单位用质量摩尔浓度（nmol/mg）表示；A1为370 nm波长处的吸光度；C为蛋白质质量浓度（mg/mL）；106为摩尔基础单位；22 000 mol/（L·cm）为摩尔吸光系数。

1.2.3.3 pH

参照Calderón-Oliver等[21]的方法，准确称取2.0 g肉糜样品与18 mL蒸馏水在50 mL烧杯中均质浸渍，静置30 min后过滤。测量前校准pH计，用PHS-25数显pH计测定各组样品的pH值。

1.2.3.4 蒸煮损失率

参照贾娜等[22]的方法并稍作修改。取冷藏肉糜样品M1（g）低速离心15 min，去除肉糜中气泡后，75℃水浴煮制30 min，冷却至室温后将熟样品表面的水分和油脂用滤纸吸掉，称重M2（g）。计算公式为：

1.2.3.5 色差值

将肉样置于面板上，用色差仪标准板校正后，垂直置于肉样之上，使镜面紧扣肉样表面不漏光，随机在各组样品的不同位置测定3次，得到L*值和a*值[23]，结果取平均值作为色差读数。

1.2.3.6 质构指标

参照熊杰等[24]的方法并稍作修改。将煮熟的肉糜样品切成长宽为2 cm，高度为1 cm的立方体，质构仪参数：P50铝合金探头，测试前速度5.0 mm/s，测中速度3.0 mm/s，测试后速度6.0 mm/s，初始距离10 mm，下压变形60%，时间5 s。

1.2.3.7 扫描电镜观察猪肉糜微观结构

将样品浸泡于2.5%戊二醛溶液（pH 7.3）中固定24 h。固定完成后将样品用磷酸缓冲液（pH 7.3）清洗，然后分别用50%、70%、80%、90%的乙醇梯度脱水各15 min，再用100%乙醇脱水3次，每次8～10 min，最后冷冻干燥24 h。将冻干样品切成2～3 mm薄片并进行喷金处理，然后置于扫描电镜下观察（×500）。

1.2.4数据处理

数据统计分析采用SPSS 22.0软件中的ANOVA进行邓肯（Duncan）检验，P＜0.05代表差异具有显著性。采用Microsoft Excel和Origin 2019软件处理试验数据及制表绘图，运用Winmuster软件进行PCA分析。结果表示为±s。

2 结果与分析

2.1 香辛料提取物比例的筛选

TBARS值是动物性脂肪中不饱和脂肪酸氧化降解产生的衍生物与TBA反应的结果，与脂肪氧化程度呈正相关，是评价脂质氧化程度的重要指标之一[25]。由图1可以看出，在冷藏期间，空白组TBARS值显著高于复合香辛料提取物组（P＜0.05），说明复合香辛料提取物可有效抑制猪肉糜脂肪氧化。在4组复合香辛料提取物中，桂皮∶生姜∶八角茴香质量比2∶2∶1组TBARS值显著低于其他3组（P＜0.05），说明添加桂皮∶生姜∶八角茴香提取物复配质量比为2∶2∶1时抑制冷藏猪肉糜氧化效果最佳。

图1 不同配比的复合香辛料提取物对冷藏猪肉糜TBARS值的影响Fig.1 Effects of different proportions of compound spice extracts on TBARS value of refrigerated minced pork

2.2 复合香辛料提取物对冷藏猪肉糜脂肪氧化的影响

由图2可以看出，冷藏过程中各处理组肉糜的TBARS值整体呈上升趋势，其中空白组第7天的TBARS值约为第1天时的4倍，上升幅度最大。说明随着冷藏时间的延长，猪肉糜中脂肪氧化程度日益严重，进一步分解成醛、醇、酮类等小分子氧化产物[26]。香辛料提取物处理组的TBARS值均显著低于空白组（P＜0.05)，说明复合香辛料提取物能有效抑制猪肉糜中脂肪的氧化。在冷藏后期，添加0.7%和1.1%浓度组的香辛料提取物TBARS值显著低于0.3%浓度组（P＜0.05），而0.7%和1.1%两组之间差异不显著。与该研究相似，孙钦秀等[27]将复合香辛料提取物添加至哈尔滨风干肠中，结果表明香辛料提取物可在一定程度上抑制风干肠的脂肪氧化。

图2 复合香辛料提取物对冷藏猪肉糜TBARS值的影响Fig.2 Effect of compound spice extracts on TBARS value of refrigerated minced pork

综上所述，复合香辛料提取物对肉糜的脂肪氧化有显著的抑制效果，随着添加量的增加，抑制效果越明显，当提取物溶液浓度达到0.7%时其抑制效果与阳性对照组相近。因此，添加0.7%浓度的复合香辛料提取物即可有效抑制肉糜的脂肪氧化。

2.3 复合香辛料提取物对冷藏猪肉糜蛋白质氧化的影响

除脂质氧化外，蛋白质氧化是肉制品劣变的另一个主要原因。肌原纤维蛋白中富含巯基，因此常用巯基含量的变化来判定蛋白质的氧化程度[28]。如图3所示，随着冷藏时间的延长，各处理组巯基含量显著下降（P＜0.05），这是由于巯基易被自由基攻击，氧化形成分子间二硫键，直接影响蛋白质的结构，并进一步影响其功能特性[29]。在冷藏后期，空白组的巯基含量显著低于其他4组（P＜0.05），说明复合香辛料提取物对肉糜蛋白的巯基具有保护作用，可减缓巯基的丢失；添加0.3%浓度组的巯基含量显著低于0.7%和1.1%组（P＜0.05），而0.7%组、1.1%组与0.02%BHA组三者之间差异不显著。

图3 复合香辛料提取物对冷藏猪肉糜总巯基含量的影响Fig.3 Effect of compound spice extracts on total sulfhydryl content of refrigerated minced pork

蛋白质氧化的另一显著变化是羰基化合物的形成，通过测定羰基含量可判定蛋白质氧化的程度[30]。当肌原纤维蛋白暴露于氧气环境中时，活性氧攻击肌肉蛋白质，导致许多氨基酸残基的侧链被氧化、肽键裂解，产生羰基化合物[31]。由图4可见，随着冷藏时间的延长，各处理组羰基含量呈不同程度增加，其中空白组羰基含量显著高于其他4个处理组（P＜0.05），说明复合香辛料提取物可有效减少猪肉糜中蛋白质的氧化损伤。在冷藏后期，3个浓度的复合香辛料提取物组中，添加0.7%和1.1%浓度组的羰基含量显著低于0.3%浓度组（P＜0.05），而0.7%组和1.1%组之间差异不显著。

图4 复合香辛料提取物对冷藏猪肉糜羰基含量的影响Fig.4 Effect of compound spice extracts on carbonyl content of refrigerated minced pork

综上所述，添加0.7%浓度的复合香辛料提取物即可有效抑制冷藏过程中肉糜蛋白的氧化反应，减缓巯基的丢失和羰基含量的增加，其抑制效果与阳性对照组相当。

2.4 复合香辛料提取物对冷藏猪肉糜pH的影响

pH是反映肉品新鲜程度的重要指标。由图5可以看出，各处理组猪肉糜的pH均随着冷藏时间的延长呈先降低后升高的趋势。这是由于冷藏初期肉糜中肌糖原发生无氧酵解产生乳酸，导致pH逐渐降低；随着冷藏时间的延长，肉糜中蛋白质被微生物和酶分解产生一系列氨及胺类碱性化合物，从而导致pH升高[32]。空白组贮藏第7天时pH达到6.8，显著高于各香辛料提取物组（P＜0.05），说明香辛料提取物起到了抑制pH升高的效果。陈璐[33]的研究也表明，香辛料提取物能抑制牛肉丸储藏过程中腐败菌的生长，延缓肉pH的升高。在储藏后期，添加1.1%浓度组的pH显著低于0.3%和0.7%组（P＜0.05），但与BHA组的pH差异不显著，说明1.1%浓度的复合香辛料提取物可起到有效抑制pH升高的效果。

图5 香辛料提取物对冷藏猪肉糜pH的影响Fig.5 Effect of compound spice extracts on pH of refrigerated minced pork

2.5 复合香辛料提取物对冷藏猪肉糜蒸煮损失的影响

肉的保水性直接影响其质地、风味和嫩度等食用品质，蒸煮损失越大，其保水性越差。由图6可知，随着储藏时间的延长，各处理组肉糜的蒸煮损失率不断上升，这可能是由于随着储藏时间的延长，肉糜的氧化程度加重，导致蛋白系水能力下降[34]。3组香辛料提取物组和BHA组猪肉糜的蒸煮损失率显著低于空白组（P＜0.05），说明复合香辛料提取物和BHA的添加都可提高猪肉糜的保水性。有研究表明，香辛料中的酚类物质能与蛋白质的官能团相互作用，促使功能基团充分暴露，从而促进凝胶形成过程中分子间的相互作用，提高猪肉糜的保水性[35-36]。在储藏后期，添加0.7%浓度组的蒸煮损失率显著低于添加0.3%和1.1%浓度的复合香辛料提取物处理组（P＜0.05）。因此，添加0.7%浓度的复合香辛料提取物可有效抑制冷藏猪肉糜蒸煮损失率的升高。

图6 香辛料提取物对冷藏猪肉糜蒸煮损失率的影响Fig.6 Effect of compound spice extracts on cooking loss rate of refrigerated minced pork

2.6 复合香辛料提取物对冷藏猪肉糜色差值的影响

肉及肉制品的颜色是消费者判断肉新鲜度和品质的重要特征。如表1所示，随着冷藏时间的延长，各处理组的L*值和a*值整体呈下降趋势。在冷藏期间，空白组的L*值显著高于各香辛料提取物组和BHA组（P＜0.05），这可能是由于香辛料提取物和BHA的添加提高了肉糜内部的保水性，降低了样品表面水分的渗出程度，减弱了光对肉表面的反射程度，导致L*值下降[37]。在冷藏第7天，空白组的a*值显著低于0.3%和0.7%浓度香辛料提取物和BHA组（P＜0.05），这可能是因为复合香辛料提取物和BHA在一定程度上抑制了肌红蛋白的氧化，延缓了肉糜颜色加深。冷藏后期（5～7 d），添加1.1%浓度组的a*值显著低于0.3%和0.7%浓度组（P＜0.05），这可能是由于复合香辛料提取物本身为棕褐色，添加浓度较高时会对肉色造成一定的负面影响。

表1 复合香辛料提取物对冷藏猪肉糜颜色的影响Table 1 Effect of composite spices extracts on color of refrigerated minced pork

2.7 复合香辛料提取物对冷藏猪肉糜质构特性的影响

表2为不同储藏时间猪肉糜硬度、弹性、咀嚼性和回复性等质构指标的变化情况。由表2可见，随着冷藏时间的延长，空白组肉糜的硬度和弹性均呈现下降趋势，香辛料提取物组的硬度和弹性均呈先增加后降低的趋势。冷藏5～7 d，香辛料提取物组的硬度、弹性、咀嚼性和回复性显著高于空白组（P＜0.05），分析原因可能是复合香辛料提取物与蛋白质发生共价或非共价的结合，形成了稳定的网络结构，抑制了蛋白的氧化变性，保持了肉糜的质构特性；从贮藏第3天起，添加0.7%浓度组和1.1%浓度组之间的硬度、弹性、回复性和咀嚼性均高于0.3%浓度组。与此研究结果类似，殷燕等[38]研究表明八角茴香提取物不仅能提高肉饼的硬度、回复性等质构特性，还能在一定程度上改善猪肉饼的色泽和风味。综上所述，添加0.7%浓度的香辛料提取物即能较好地保持猪肉糜的质构特性，具有更加显著的保鲜效果。

表2 复合香辛料提取物对冷藏猪肉糜质构特性的影响Table 2 Effect of compound spices extracts on texture characteristics of refrigerated minced pork

2.8 扫描电镜对猪肉糜微观结构的观察

肌肉的组织结构能够反映出其氧化程度，网状结构越紧密，表明肉质越新鲜[39]。图7为各处理组猪肉糜在冷藏第5天的扫描电镜图。由图7可知，空白组由于脂肪流失，出现较大的孔洞，网状组织结构疏松。与空白组相比，香辛料提取物组和BHA组肉糜组织结构较完整，孔洞较少，脂肪流失相对较少，说明添加香辛料提取物和BHA使肉糜网络结构更加连续、紧凑，并且3组不同添加量的香辛料提取物处理组中，0.7%和1.1%浓度组样品的组织结构较好，其结构与BHA组完整度相似。综上所述，添加香辛料提取物能够减缓氧化诱导引起的微观结构改变，使肉糜组织结构较为均匀且光滑。

图7 扫描电镜下复合香辛料提取物对猪肉糜微观结构的影响Fig.7 Effect of compound spice extracts on microstructure of refrigerated minced pork under scanning electron microscope

3 结论

本研究首先对复合香辛料提取物的复配比例进行了筛选，结果表明，当添加桂皮∶生姜∶八角茴香提取物复配质量比为2∶2∶1时，抑制冷藏猪肉糜氧化效果最佳。复合香辛料提取物对冷藏期间猪肉糜脂肪和蛋白质氧化影响的研究结果表明，在冷藏后期，添加复合香辛料提取物组的TBARS值、巯基丢失量、羰基含量均显著低于空白组（P＜0.05），且添加0.7%浓度即可达到有效抑制猪肉糜脂肪和蛋白氧化的作用；复合香辛料提取物对冷藏猪肉糜品质影响的研究结果表明，在冷藏后期，3个不同浓度组猪肉糜的pH、蒸煮损失、颜色和质构特性较空白组均有显著改善，并减少了氧化诱导引起的肉糜微观结构的改变。但由于提取物本身颜色较深，添加1.1%浓度组a*值较低，对猪肉糜色泽有一定的负面影响。综上所述，添加桂皮、生姜、八角茴香复合香辛料提取物抑制猪肉糜氧化效果显著，并可减缓其pH、保水性、质构特性和微观结构等品质的劣变。