微波和紫外线诱导灵芝耐热品种的比较研究

袁学军，吴 翼，赵润江，王小妹，江萌萌 ，洪 柳

(1.海南热带海洋学院 民族学院，海南 三亚 572000；2.中国热带农业科学院椰子研究所，海南 文昌 571399)

0 引言

据《中国灵芝图鉴》记载[1]，中国已知野生灵芝分4 属，103种，其中海南分布的灵芝有72 种，约占全国灵芝总种数的70%。有药用价值的灵芝达15种，其中11 种已被利用并报道[2]。目前，国内外学者已经对药用灵芝中的活性成分进行较多研究，例如灵芝活性蛋白[3]、灵芝多糖[4]、灵芝三萜[5]和灵芝酸[6]，但对灵芝品种的选育和改良研究则较少[7-8]。灵芝菌丝生长的温度范围为25～35 ℃，最适温度为24～28 ℃，超过36 ℃菌丝停止生长。本试验研究微波和紫外线诱导对菌丝生长的影响，选育出耐热灵芝品种。同时为食用菌耐热品种筛选方法提供依据。

紫外线诱变技术是人类最早使用的诱变育种技术之一，核酸紫外线最大的吸收峰在260 nm，因此，波长为260 nm的紫外线诱变最有效[9]。当紫外线被吸收后，会引起DNA分子突变，甚至可以使正常的DNA分子颠换、移码突变、转换、缺失等，对DNA分子造成不可逆转的改变[10]。刘瑛颖[11]用紫外线照射猪苓菌丝后，菌丝的生长速率发生改变，照射7 min时产生的变异菌株U1-7生长速率最快；陈力力等[12]67用频率为2 540 MHz的微波炉，处理菌种80 s，获得优势突变株W8011，连续8代遗传性能稳定，并比较了紫外线、微波单因子对金针菇J05Y-c单细胞悬液的诱变效应，微波诱变的正突变率大于紫外诱变的正突变率，分别为85.0%和76.7%。因此，紫外线和微波照射对食用菌诱变育种是有效的。

1 材料与方法

1.1材料

灵芝菌种由海南省林业科学研究院提供：海南灵芝(Ganodermahainanense)、台湾灵芝(Ganodermaformosanum)、四川灵芝(Ganodermasichuanense)、灵芝(Ganodermalucidum)。

1.2方法

1.2.1微波诱导

灵芝菌种接种到带有PDA培养基的培养皿(直径8 cm)中，25 ℃培养24 h，分别放入微波炉(微波频率2 450 MHz，波长122 mm)处理0 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 s，微波0 s处理设为对照，然后在恒温培养箱中分别在不同温度(39 ℃、40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃)下进行培养，每个处理设置3个平行样，培养第8天测量菌丝半径，计算其生长速度，单位为cm · d-1，分析微波对灵芝菌丝生长速度和诱导耐热品种的影响。

1.2.2紫外线诱导

灵芝菌种接种到带有PDA培养基的培养皿(直径8 cm)中，25 ℃培养24 h，分别进行紫外线照射(超净工作台中的紫外线灯管单只，紫外线波长253.7 nm，培养皿放置在灯管正下方，灯管与培养皿的距离为47 cm)0 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min，紫外线照射0 min设为对照，然后在恒温培养箱中分别在不同温度(38 ℃、39 ℃、40 ℃、41 ℃)下进行培养，每个处理设置3个平行样，培养第8天测量菌丝半径，计算其生长速度，单位为cm·d-1，分析紫外线对灵芝菌丝生长速度和诱导耐热品种的影响。

1.2.3 DNA的提取和PCR扩增

DNA的提取步骤如下：

步骤1：DNA的提取按照试剂盒提取DNA的方法，取适量菌丝放置于2 mL离心管中，并加入钢珠压在样品上方，然后加入400 μL缓冲液和6 μL的RNaseA(10 mg·mL-1)，漩涡震荡1 min，室温放置10 min。

步骤2：加入130 μL缓冲液FP，充分混匀，漩涡震荡1 min。

步骤3：12 000 r·min-1离心5 min，将上清液转移至新的离心管中。

步骤4：重复步骤3一次。

步骤5：取500 μL的上清液，加入0.7 μL的异丙醇，充分混匀，此时会出现絮状基因组DNA，12 000 r·min-1离心2 min，弃上清，保留沉淀。

步骤6：加入600 μL 70%的乙醇，漩涡震荡5 s，12 000 r·min-1离心2 min，弃上清。

步骤7：重复步骤5一次；开盖倒置，室温5～10 min彻底晾干乙醇。

步骤8：加入适量洗脱缓冲液TE，65 ℃水浴10～60 min溶解DNA，其间数次颠倒助溶，最终得到DNA溶液。

灵芝与双孢菇亲缘关系较近，双孢菇耐热基因及对应引物已克隆[13]，参考其引物，灵芝全长基因PCR扩增所用的特异引物根据基因两端的序列设计。

5′端引物为028-1F：5′-TCTTCACGTGCTGCCACCAA-3′，

3′端引物为028-1R：5′-TTTTTTTTTTAAAAGGCCCA-3′。

以上引物均由上海生工生物工程公司合成。

PCR扩增以上述提取的DNA为模板,用基因两端特异引物028-1F和028-1R进行PCR扩增，退火温度52 ℃。PCR结束后，在135 V的电压下进行30 min的凝胶电泳以确定扩增条带。

1.2.4统计分析

采用南京农业大学王韶华教授发明的stst软件进行统计分析。

2.结果与分析

2.1 微波和温度共同作用对台湾灵芝生长速度的影响

微波和温度共同作用对台湾灵芝生长速度的影响见表1。随着微波诱导时间的增长和温度的升高，菌丝生长速度变慢，微波处理40 s的菌丝停止生长的温度为43 ℃，其他所有处理的停止生长的温度均为42 ℃。因此，微波处理40 s的效果最佳，能提高菌丝的耐热性；微波处理60 s时,所有处理的菌丝全部死亡，可能是随着微波诱导时间的增长，温度越来越高的原因。对照菌丝停止生长的温度为42 ℃，根据拟合方程y=-0.132 5x+5.489 3的拟合结果为41.43 ℃。

表1 微波和温度共同作用对台湾灵芝生长速度的影响

2.2 微波和温度共同作用对海南灵芝、四川灵芝生长速度的影响

微波和温度共同作用对海南灵芝生长速度的影响见表2。随着微波处理时间的增长和温度的升高，菌丝生长速度变慢，微波处理60 s的菌丝停止生长的温度为44 ℃，而对照和其他处理的停止生长的温度均为43 ℃。因此，微波处理60 s效果最佳，菌丝停止生长的温度最高。微波处理70 s时，菌丝全部死亡。对照菌丝停止生长的温度为43 ℃，根据拟合方程y=-0.097 5x+4.19的拟合结果为42.97 ℃。

表2 微波和温度共同作用对海南灵芝生长速度的影响

四川灵芝、灵芝微波诱导和对照菌丝停止生长温度均为40 ℃，微波诱导对其菌丝停止生长的温度没有影响。但在微波作用下台湾灵芝和海南灵芝的耐热性显著提高，说明微波对灵芝耐热性具有一定的诱导性。四川灵芝和灵芝微波诱导停止生长的温度和对照相同(数据省略)。

2.3 紫外线和温度组合对四川南灵芝生长速度的影响

紫外线和温度组合对四川南灵芝生长速度的影响见表3。紫外线处理60 min，菌丝停止生长的温度为41 ℃。随着紫外线处理时间的延增长和温度的升高，菌丝生长速度均呈下降趋势。因此，紫外线处理60 min效果最佳，菌丝停止生长的温度最高，可能分子结构发生变化。紫外线处理4 h，菌丝常温25 ℃培养还没有出现死亡现象。对照菌丝停止生长温度为40 ℃，根据拟合方程y=-0.156x+6.177的拟合结果为39.59 ℃。

表3 紫外线和温度共同作用对四川灵芝生长速度的影响

2.4 紫外线和温度共同作用对灵芝、台湾灵芝生长速度的影响

紫外线和温度共同作用对灵芝生长速度的影响见表4。随着紫外线处理时间的增长和温度的升高，菌丝的生长速度逐渐变慢。紫外线处理60 min的菌丝停止生长温度为41 ℃，而其他所有处理的停止生长温度均为40 ℃，因此，紫外线处理60 min效果最好。对照菌丝停止生长温度为40 ℃，根据拟合方程y=-0.156x+6.153 3的拟合结果为39.44 ℃。

紫外线处理后台湾灵芝与对照菌丝的停止生长温度相同，均为42 ℃，而海南灵芝均为43 ℃，由此可见，紫外线照射对这两个品种耐热性提高的效果不显著。

表4 紫外线和温度共同作用对灵芝生长速度的影响

2.5诱导耐热灵芝品种分子鉴定

通过微波和紫外线诱导处理，本试验诱导出4个耐热品种，PCR结果如图1所示。台湾灵芝对照组和诱导组均有3个条带，无差异；海南灵芝对照有1个条带，而诱导的有3个条带，比对照多2条；四川灵芝对照无条带，而诱导的有3个条带，比对照多3条；灵芝对照和诱导的均有3个条带，无差异。因此，诱导的耐热品种中台湾灵芝和灵芝与对照在分子结构上相同，无差异；而海南灵芝诱导组比对照组多2个条带，四川灵芝诱导组比对照组多3个条带，诱导的和对照在分子水平上存在差异。诱导的海南灵芝菌丝停止生长温度为43 ℃，诱导的四川灵芝停止生长的温度为41 ℃。因此，通过分子鉴定，海南灵芝和四川灵芝各自的诱导组和对照组存在差异。

1.marker(分子量大小，DL2000);2.台湾灵芝诱导组;3.台湾灵芝对照组;4.海南灵芝诱导组;5.海南灵芝对照组;6.四川灵芝诱导组;7.四川灵芝对照组;8.灵芝诱导组;9.灵芝对照组。

3 结论

台湾灵芝、海南灵芝、四川灵芝和灵芝的菌丝停止生长的温度分别为42 ℃、43 ℃、40 ℃、40 ℃，微波诱导后台湾灵芝、海南灵芝的菌丝停止生长的温度分别为43 ℃、44 ℃，紫外线诱导后四川灵芝和灵芝的菌丝停止生长的温度都为41 ℃，这说明微波和紫外线诱导对灵芝的耐热性有一定的影响。微波炉在发出微波的同时伴随着温度的升高，因此微波诱变可能是微波和温度共同作用的结果；紫外线具有杀菌的作用，一般情况下，紫外线杀菌仅用30 min细菌即可死亡，但灵芝菌丝在紫外线照射4 h后还能生长，因此，此现象还需继续研究。

本试验通过紫外线和微波诱导出灵芝的耐热品种，其结果与陈力力等[12]69采用微波和紫外线诱导出新菌株结果一致。双孢菇耐热基因的引物在灵芝中的应用有明显的效果。因此，双孢菇的耐热基因也可能在其他食用菌上试用。同时，诱导的突变体只有表观指标和分子水平均存在差异，才能成为真正的突变体，才能遗传。