基于转录组测序解析翘嘴鳜适应人工饲料的分子机制

刘鼎瑞，欧阳号锋，黄景军;，韩林强，李水生，李桂峰，严保华，侯玉洁，林浩然，张 勇

(1.中山大学 a.生命科学学院；b.广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广州 510275；2.广东梁氏水产种业有限公司，广东 佛山 528100；3.南昌市农业科学院，南昌 330299)

0 引言

翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)属于鲈形目，鮨科，翘嘴鳜亚科。翘嘴鳜是我国大宗淡水养殖鱼类中经济价值很高的养殖品种，分布广泛[1]，味道鲜美，深受广大消费者喜爱。

翘嘴鳜是一种凶猛的肉食性鱼类[2]，以活的鱼类和其他水生动物为食，拒绝摄食死鱼[3]。这种独特的摄食习性可能与多个因素有关，比如视黄醇通路[4]、学习和记忆[5]、食欲控制和昼夜节律等[6]。传统活饵料鱼养殖方式导致养殖病害易水平传播、疫病高发、养殖成活率低，而使用违禁药物又存在隐患。

鉴于上述情况，人们开始尝试使用人工饲料驯化翘嘴鳜[7]。人们将肉食性鱼类从摄食活饵料鱼驯化成为摄食人工饲料已有成功案例，比如大口黑鲈(Micropterussalmoides)[8]。与传统喂养活饵料鱼的养殖模式相比，喂养人工饲料不仅可以大幅减少翘嘴鳜养殖的成本[9]，还可以避免通过饵料鱼传播的潜在疾病。然而，改变肉食性鱼类食性，摄食人工饲料存在一些潜在的问题，比如，投喂人工饲料会使大口黑鲈产生氧化应激并抑制先天免疫，最终影响大口黑鲈的健康状况[10]。在翘嘴鳜中，人工饲料会对翘嘴鳜产生什么样的影响尚未清楚，所以，在人工饲料养殖下，我们开展了翘嘴鳜生长代谢与免疫应激等生理变化的研究。

1 材料和方法

1.1 样品采集

本实验由广东梁氏水产种业有限公司提供大小规格一致的翘嘴鳜共180尾。其初始体长为(7.57±1.39)cm，初始体质量为(37.61±4.58)g。将其分为两组：处理组(使用人工饲料喂养)和对照组(使用活饵料鱼喂养)。处理组中使用的人工饲料为购自佛山市南海区杰大饲料有限公司的翘嘴鳜专用配合饲料，对照组中使用的饵料鱼为鲮鱼(Cirrhinusmolitorella)苗。在养殖120 d后，分别从处理组和对照组各随机选择50尾鱼进行生长数据统计，记录体长和体质量。另外随机从对照组及实验组中分别选择3尾鱼进行解剖取样，解剖前使用MS-222(Westgene公司)对翘嘴鳜进行麻醉以减少疼痛。然后分别采集对照组鱼体的肝脏(CL组)及脑(CB组)与实验组鱼体的肝脏(FL组)及脑(FB组)组织样品。

1.2 cDNA文库构建和测序

步骤1：使用TRIzol试剂(Invitrogen,美国)提取总RNA。

步骤2：分别使用Bioanalyzer 2100系统(Agilent Technologies,美国)的RNA Nano 6000 Assay Kit和NanoPhotometer®分光光度计(IMPLEN,美国)检测并测试RNA的完整性和纯度。

步骤3：使用NEBNext®UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina®(NEB，美国)生成序列库，并在cBot聚类生成系统上对样品添加索引代码进行聚类，构建测序文库。

步骤4：使用Illumina Novaseq平台对文库进行测序(北京诺禾致源科技股份有限公司，天津)。

1.3 数据分析和功能注释

测序后使用in-house Perl脚本处理fastq格式的原始数据(raw reads)进行质量控制，以获得干净数据(clean reads)。使用Hisat2 v2.0.5建立索引，并将clean reads与参考基因组进行比对。按照Pertea等人[11]的方法，使用StringTie(v1.3.3b)来组装比对后的数据。

1.4 差异表达基因(DEGs)分析

DESeq2 R包(1.16.1)被用来分析差异表达基因(DEGs)。使用Benjamini和Hochberg方法调整P值以获得明显的差异性表达。使用Cluster Profiler R包进行京都基因与基因组百科全书(KEGG：Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)和基因本体(GO：Gene Ontology)富集分析。

1.5实时定量PCR(qPCR)

为了验证RNA-Seq数据的可靠性，选择肝脏和脑组织中9个差异表达基因(DEGs)进行实时定量PCR验证。表1为用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的引物，分别选择糖代谢相关蛋白葡萄糖激酶引物(GCK)、葡萄糖激酶调节蛋白引物(GCKR)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶引物(PEPCK)，脂代谢相关基因脂蛋白脂肪酶引物(LPL)，摄食相关基因神经肽Y引物(NPY)，免疫相关基因单酰基甘油酰转移酶1引物(MGAT1)、单酰基甘油酰转移酶4引物(MGAT4)，人生长停滞DNA损伤可诱导蛋白α引物(GADD45α)、α肿瘤坏死因子引物(TNF-α)的基因进行引物设计，其扩增效率均为90%～100%。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

表1 (续)

按照1.2节所述提取总RNA，使用ReverTra Ace®qPCR RT Master Mix with gDNA Remover kit(TOYOBO)合成第一链cDNA。使用引物设计软件Primer premier 5设计特定引物。在Roche LightCycler480实时PCR系统上进行实时定量PCR(qRT-PCR)分析，按照说明书使用SYBR Green I Master Mix(Roche)。PCR条件如下：95 ℃，10 min，然后进行40个循环，95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃，20 s。选择β-actin作为内参基因，使用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

2 结果

2.1 生长表现

在使用人工饲料和活饵料鱼喂养翘嘴鳜120 d后，分别从处理组和对照组中各随机抽取50尾鱼测量其生长数据，计算平均值，并使用非配对t检验统计显著性差异。饲养120 d后，处理组的体长为(19.48±2.35) cm，体质量为(140.27±53.83) g，对照组体长为(28.45±2.74) cm，体质量为(407.03±109.12) g。处理组的平均体长和体质量与对照组有显著差异，处理组的体长较短，体质量较小(图1)。

****表示P<0.000 1。图1 处理组与对照组的生长表现

2.2 转录组数据的初步分析

使用Illumina HiSeqTM2000进行cDNA文库测序后，在处理组的肝脏(FL组)和处理组的脑(FB组)中分别获得42 796 015，46 129 992条原始数据，在对照组的肝脏(CL组)和对照组的脑(CB组)中分别获得44 900 185，44 054 696条原始数据。进行过滤后FL、FB、CL和CB组中分别产生了41 451 466，44 876 309，43 077 980和42 240 382条干净数据。在所有文库中Q20(某一碱基质量值占全部碱基数的20%)不小于96%，Q30(某一碱基质量值占全部碱基数的30%)不小于90%(表2)，结果表明测序质量非常高，可以进行后续分析。

表2 转录组数据分析

2.3 转录组数据与参考基因组的比对效率分析

比对效率即与参考基因组比对上的数据占干净数据的百分比。本研究中转录组数据与参考基因组的比对效率均高于90%。其中处理组6个样本的比对效率均超过90%，最高的为94.95%；对照组6个样本的比对效率均超过90%，最高的为95.53%。比对结果显示转录组数据可靠，可以用于后续研究，比对结果见表3。

表3 转录组数据与参考基因组的比对效率

2.4 DEGs的分析

使用R包deseq2，以差异表达倍数(FC，记为FC)的对数值|log2FC|>2和Padj<0.05(Padj表示修正过的P值)为筛选条件，分别对FL、FB、CL和CB组的差异表达基因进行分析。结果显示处理组和对照组的组间基因表达量存在差别，且差别则较为明显(图2)。RNA-seq结果显示在FL组和CL组之间有1 064个差异表达基因(DEGs)，其中586个基因上调，478个基因下调。FB组和CB组之间有233个差异表达基因(DEGs)，其中83个基因上调，150个基因下调(图3)。在FL组和CL组之间大量与葡萄糖代谢、脂质反应、对内源性刺激的反应、蛋白质分解过程、免疫反应、蛋白酶体复合体和DNA结合转录因子活性有关的DEGs被富集。

FL CL FB CB FL组为处理组肝脏，CL组为对照组肝脏， FB组为处理组脑，CB组为对照组脑。红色：表示基因表达水平高；绿色：表示基因表达水平低。图2 差异表达基因的层次聚类热图

图3 处理组与对照组各组织的差异基因火山图

2.5 GO和KEGG通路的富集分析

对处理组和对照组的差异表达基因进行GO功能富集分析，结果显示大脑中有416个GO条目被富集，肝脏中有698个GO条目被富集(图4)。肝脏作为重要的代谢器官，我们进一步研究了处理组中DEGs的GO富集情况，在生物过程类别(BP)中，对脂质的反应(GO:0033993)、对内源性刺激的反应(GO:0009719)、类固醇激素介导的信号通路(GO:0043401)、对激素的反应(GO:0009725)和蛋白质催化过程(GO:0030163)被显著富集。在细胞成分类别(CC)中，蛋白复合物(GO:0000502)和内源复合物(GO:1905369)被显著富集。在分子功能类别(MF)中，苏氨酸型肽酶活性(GO:0070003)、DNA结合转录因子活性(GO:0003700)、转录调节器活性(GO:0140110)等条目被显著富集。

对处理组和对照组的差异表达基因进行KEGG富集分析，分别有134和61条信号通路在KEGG数据库中被富集，并且分别有一条信号通路被显著富集。在富集的信号通路中，脂肪酸代谢、Toll样受体信号通路和细胞黏附分子在肝组织中更为突出，而神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路和氮代谢在脑组织中更为突出(图5)。这表明，翘嘴鳜脑中的神经配体作用以及肝脏中糖脂相关代谢可能对于翘嘴鳜适应人工饲料以及驯化有着重要的作用。

(a)处理组与对照组肝脏的富集结果 (b)处理组与对照组脑的富集结果 BP为生物过程；MF为分子功能；CC为细胞组分。图4 处理组与对照组各组织的GO富集结果

(a)处理组与对照组肝脏的富集结果 (b)处理组与对照组脑的富集结果 nC为差异表达基因数量；Padj为校正后的P值。图5 处理组与对照组各组织的KEGG富集结果

2.6 实时定量PCR对RNA-seq数据的验证

为了验证RNA-seq数据的准确性，对脑和肝脏中9个DEGs进行qRT-PCR分析，并比较qRT-PCR与RNA-seq的结果。这9个基因的表达趋势与RNA-seq中的趋势相似(图6)。因此，qRT-PCR的结果证实了RNA-seq数据的可靠性和准确性。qRT-PCR数据显示，在投喂人工饲料期间，翘嘴鳜肝脏中与糖代谢以及脂代谢有关的基因表达出现下调，促食欲基因表达出现下调，说明翘嘴鳜可能对人工饲料的接受度不高，并且糖脂代谢可能与翘嘴鳜的驯化密切相关。

(a)肝脏中相关基因的相对表达量和FPKM值 (b)肝脏中相关基因的相对表达量和FPKM值

(c)脑中相关基因的相对表达量和FPKM值 (d)脑中相关基因的相对表达量和FPKM值 *表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.000 1。图6 处理组和对照组肝脏和脑的基因表达谱

3 讨论

在对比养殖4个月后，对照组与处理组的生长出现了显著性差异，对照组的平均体质量和体长明显高于处理组。由于翘嘴鳜具有独特的摄食习惯[12]，是一种肉食性鱼类[13]，处理组的翘嘴鳜出现了食欲不振和游动缓慢等现象，这表明翘嘴鳜对人工饲料还没有形成良好的适应性。Guan等[14]比较了用人工饲料和饵料鱼喂养的大口黑鲈的生长性状。结果显示，从第20天开始，用饵料鱼喂养的大口黑鲈的体质量开始明显高于用人工饲料喂养的大口黑鲈，这与本研究结果一致。这种生长上的差异可能与人工饲料的营养成分和营养比例有关，饵料鱼中各种脂肪和蛋白质的比例或其组合形式更容易吸收。由于翘嘴鳜对人工饲料没有形成良好的适应性，使用人工饲料喂养会导致翘嘴鳜对营养物质的利用率较低，影响翘嘴鳜的生长。

与活饵料鱼相比，人工饲料最大的区别在于营养成分的不同和喂养方式的改变[15]。糖类和脂类成分在人工饲料中占较高的比例，而活饵料鱼的蛋白质成分较高[16]。作为一种肉食性鱼类，翘嘴鳜难以很好地利用糖脂类化合物。同时，人工饲料中氨基酸含量较少，这也可能会影响翘嘴鳜的新陈代谢和免疫力。碳水化合物的新陈代谢是鱼类最重要的代谢之一。碳水化合物负责提供能量，维持正常的生命活动，甚至在卵细胞的成熟过程中发挥重要作用[17]。碳水化合物的代谢包括糖酵解、三羧酸循环、磷酸戊糖途径以及其他生命过程，硬骨鱼类能够通过调节自身碳水化合物的代谢途径来控制糖的合成和分解从而影响身体的血糖水平和生物合成[18]。与哺乳动物不同，鱼类一般被认为是葡萄糖不耐受的，他们不能很好地利用或储存葡萄糖[19]。稳定的血糖水平对鱼类的生长、代谢和其他重要的生命活动起着重要作用。如果给鱼喂食过量的葡萄糖，可能会导致葡萄糖代谢紊乱，甚至引发糖化肝病[20]。在肉食性鱼类中，葡萄糖可能在特定组织或特定活动中发挥重要作用[21]。在本研究中，淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、果糖和甘露糖代谢，以及丙酮酸代谢和胰岛素信号通路都在KEGG中被富集，表明与对照组相比，肝脏中涉及这些与碳水化合物代谢有关通路的大多数基因的表达水平发生了明显变化。

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPCK)与丙酮酸羧化酶一起负责糖异生中从丙酮酸到磷酸烯醇丙酮酸的反应步骤，是糖异生过程中的一种重要限速酶。在鱼类中，PEPCK与葡萄糖的有效利用密切相关。军曹鱼(Rachycentroncanadum)是一种重要的经济鱼类，分布在热带水域，如大西洋、印度洋和太平洋(东太平洋除外)[22]。与其他肉食性鱼类不同，军曹鱼可以更有效地利用葡萄糖，这可能与它肝脏中PEPCK的表达水平有关[23]。本研究中，处理组的肝脏中PEPCK基因表达量远高于对照组，说明与对照组相比，处理组的翘嘴鳜能更有效地利用葡萄糖，这可能是由于人工饲料中的脂质成分已经超过了翘嘴鳜的代谢范围，因此翘嘴鳜必须通过糖异生作用将脂质成分转化为葡萄糖进行储存。葡萄糖激酶(GCK)是糖酵解反应的限速酶，它负责催化葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖，在调节鱼类的血糖平衡中起核心作用[24]。作为GCK的调节蛋白，葡萄糖激酶调节蛋白(GCKR)通过非共价结合与葡萄糖激酶形成非活性复合物，抑制肝脏和胰岛细胞中葡萄糖激酶的活性[25]。在本研究中，处理组GCK基因的表达水平下降，相应地，GCKR的表达水平增加。这可能是由于人工饲料中含有过多的葡萄糖，超过了翘嘴鳜的加工能力，导致翘嘴鳜的糖酵解反应减少，葡萄糖分解减少。

脂质代谢是最重要的代谢途径之一，包括甘油三酯代谢、磷脂代谢和胆固醇代谢。在血液中，脂质以脂蛋白的形式运输，根据其密度可分为乳糜微粒、低密度脂蛋白、中密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白[26]。单酰基甘油酰转移酶(MGATs)是合成三酰甘油(TAG)的关键酶，涉及许多生理功能，诸如肠道脂肪吸收、脂蛋白组装、脂肪组织形成等[27]。脂蛋白脂肪酶(LPL)主要催化水解糜烂颗粒和极低密度脂蛋白中的甘油三酯，产生脂肪酸和单酰甘油供身体组织使用[28]。本研究处理组中肝组织以及脑组织的MGAT1和MGAT4的表达水平均上调，说明在投喂人工饲料后，翘嘴鳜肠道对于脂肪的吸收和三酰甘油的合成加强。相反，处理组中LPL的表达水平受到了抑制，总的来说可能是由于人工饲料中含有丰富的脂肪酸，因此翘嘴鳜不再需要分解甘油三酯来获得脂肪，同时需要增强吸收脂肪的基因表达，以此来应对人工饲料中增加的脂质成分。此外，LPL基因还可能与鱼类对人工饲料的适应能力以及驯化有关。Ma等[29]发现，在大口黑鲈中，LPL的SNPs与大口黑鲈适应人工饲料的能力有关。本研究中，LPL的表达量在喂食人工饲料后出现下调。作为动物脂代谢的关键酶，这一结果可能表明，翘嘴鳜暂时还未适应人工饲料。

在肝脏中，人工饲料主要影响翘嘴鳜的生理代谢，对糖代谢和脂质代谢产生影响。而在大脑中，人工饵料则会对翘嘴鳜的摄食调节产生影响。神经肽Y(NPY)是一种广泛分布于中枢和外周神经系统的神经肽[30]。在水产养殖领域，NPY一直是鱼类摄食调节的研究重点,它被认为与鱼类摄食行为的机制[31]、斑马鱼运动功能的恢复[32]、免疫[33]和焦虑等行为[34]有关。NPY的主要功能是增加食物摄入和减少饱食动物的生热作用[35]。在金鱼(Carassiusauratus)[36]、斑马鱼[37]和罗非鱼[38]中，已经发现NPY与鱼类摄食行为的调节有关，是鱼类摄食调节中极为重要的神经肽。本研究中，处理组脑内NPY的表达水平明显下降，这与He等[6]的转录组研究结果一致。这表明，食欲低下的翘嘴鳜可能更容易接受人工饲料，食欲高的翘嘴鳜倾向于追逐活跃的饵料鱼，拒绝吃静止的人工饲料。

本研究转录组数据显示，免疫相关途径在KEGG数据库中被富集,这与大口黑鲈的相关研究结果一致。当大口黑鲈进食人工饲料时，其免疫相关基因会在分子水平上被上调[39]。研究表明，高糖饮食可能会增加非酒精性脂肪肝(NAFLD)的风险[40]。当血脂水平高时，幼鲈的生长，肝脏代谢酶和抗氧化能力将受到影响[41]。因此，在养殖过程中，如果翘嘴鳜摄入糖脂含量较高的饲料，可能会对应地产生免疫反应。TNF-α是一种多效细胞分子,在炎症、细胞凋亡和免疫系统发育中起着核心作用，在调节鱼类的各种生理过程中起着关键作用，并且与肿瘤的产生和发展密切相关[42]。GADD45α基因编码的蛋白是一种应激蛋白，对环境做出反应，在DNA修复、细胞周期调节、衰老、基因毒性应激反应和其他细胞功能中起着重要的调节作用[43]。在本研究中，TNF-α和GADD45α的表达在处理组的肝脏和脑中均有上调，这说明投喂人工饲料可能会引起翘嘴鳜肝脏和大脑的炎症反应，使翘嘴鳜产生免疫反应。与传统饵料鱼相比，人工饲料的蛋白质来源不同，糖类和脂类的含量较高。因此，翘嘴鳜在摄入人工饲料后或无法较好地利用营养物质，导致糖类和脂类成分的积累，最终导致翘嘴鳜产生炎症反应。

本研究发现投喂人工饲料会影响翘嘴鳜的代谢、免疫和摄食调节。其中，碳水化合物代谢和脂质代谢可能会对翘嘴鳜适应人工饲料产生重要影响。研究结果可为翘嘴鳜饲料驯化养殖提供基础数据，促进翘嘴鳜饲料配方和养殖技术的发展。