侧流免疫层析技术的研究进展

2022-11-01黄正壮

黑龙江科学 2022年20期

黄正壮

(南宁市第一人民医院，南宁 530016)

0 引言

传统的实验室分析方法包括气相色谱-质谱(GC-MS)、超高效液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)、高压液相色谱(HPLC)、酶联免疫吸附分析(ELISA)和生物传感器等，其大多敏感性好但耗时长，需要昂贵的仪器设备和专业人员[1]。过去的几十年里，科学研究重点越来越多的放在开发和优化便携、廉价、易用的快速诊断实验上[2]。而免疫化学生物分析方法因其高度的特异性和灵敏性备受关注。目前，大多数筛查和快速方法都是基于免疫分析。该方法基于分析物/抗原(Ag)与选择性抗体(Ab)反应，形成Ab-Ag复合物。免疫分析的有效性主要取决于抗体-Ag复合物形成的效率和检测复合物的形成速度[3]。

侧流免疫层析技术(lateral flow immunoassay，LFIA)是迄今为止对目标物质进行现场检测最成功的分析平台之一，检测速度快，简单易用，价格低廉，应用广泛，已从用于临床分子、生物体和(生物)标志物检测扩展到其他领域，包括食品和饲料安全、兽医、环境控制诸多领域。LFIA具有快速、简便、易读、现场适用性好、保质期长、所需体积小、生产成本相对较低、灵敏度和特异度好、可与电子和电化学系统集成等优点[4]，适用于检测多种样本类型，可以在15 min内完成检测，通过对抗体、标记剂和运行缓冲液等试剂进行优化。LFIA设备可以在室温下储存至少2年，非常适合在资源有限的条件下使用[5]。

1 LFIA的基本组成

LFIA由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，其按顺序固定于背板上面，组成测试试纸条[6]。

样品垫作为反应的起始点，主要起到加载样品的作用，材料一般为聚酯纤维膜或玻璃纤维膜。为保证样品垫能屏蔽样品内非目标基质对目标基质的检测干扰，处理不同标本时，根据标本的不同，通常需要不同的预处理液对样品垫进行预处理。

金标结合垫一般由吸水性和均一性良好的玻璃纤维、无纺布或聚酯纤维制成，根据使用要求的不同，对结合垫的材料、厚度、释放速度和浸泡前处理进行调整，以保证结合物的结合稳定性及持续均匀地迁移至硝酸纤维素膜上。

硝酸纤维素膜是整个试纸条的检测区域，根据检测样品的不同，可以在硝酸纤维素膜上包埋不同的抗原或检测抗体对样品进行检测。不同孔径和不同液体迁移速度的硝酸纤维素膜有不同的特性，可以根据实验需要进行选择。

吸水垫主要用于吸收废液，一般由性能稳定、吸水量大、吸水性能好的吸水纸制作而成。

衬板主要用于对各个组成部分的支撑和组装，一般由PVC材料制成[7]。

图1 胶体金免疫层析试纸条结构图Fig.1 Structural diagram of colloidal gold immunochromatographic test strips

如图1所示，T检测线与C质控线固定在硝酸纤维素膜上，金标结合垫固定了纳米标记物，当样品滴加到样品垫上时，由于毛细作用，检测样品从样品垫方向吸水垫方向流动，流经金标结合垫时，样品与金标结合垫上的纳米粒子-抗体复合物发生反应形成样品-纳米粒子-抗体复合物。当样品-纳米粒子-抗体复合物流经硝酸纤维素膜时，又分别与硝酸纤维素膜上的T检测线与C质控线发生反应，然后根据T线和C线上的显色程度进行结果判定[8]。

2 应用进展

目前，基于LFIA的设备已被广泛用于临床、兽医、农业食品和环境等领域，能够检测蛋白质、核酸、药物、激素、毒素、病毒和细菌等[4]。基于以往的研究可以看到，LFIA结构方面，许多纳米粒子如脂基纳米粒子、聚合物纳米粒子及无机纳米粒子及量子点、磁性、陶瓷和金属纳米粒子(铜、银、金、铁)，被广泛应用于细菌感染检测上。在这些金纳米粒子中，金纳米粒子(AuNPs)由于其表面功能化、优异的化学稳定性、生物识别和信号放大特性，提高了与捕获抗体的偶联性，并在LFIA试条上充当具有独特光学特性的颜色标记，能比其他纳米粒子更有效地对细菌感染进行检测[9]。基于金属纳米颗粒(MNPs)的标记，特别是金纳米颗粒(AuNPs)和银纳米颗粒(AgNPs)具有良好的分析性能、高灵敏度和对多种检测格式的适应性，在荧光定量分析中得到了广泛应用。不仅如此，基于金属纳米颗粒(MNPs)的标记可以为LFIA膜的光谱学或光学成像提供定量信息。通常使用包括光源、用于收集最佳光信号的光学透镜和易于使用的检测器(如互补金属氧化物半导体(CMOS)或电荷耦合器件(CCD)相机)，通过测量对应于T线和C线的信号并对背景信号进行信号校正，和预先存储的校准曲线进行比对来获得目标分析物浓度。基于智能手机的LFIA，通过使用智能手机上配备的闪光灯、高性能CMOS摄像头和数据处理能力，使它能对目标分析物进行定量分析，因此成为LFIA发展的新趋势[4]。

2.1 临床应用进展

孙永等利用胶体金侧向层析技术对新型冠状病毒IgG/IgM进行快速检测，检测可以在10 min内完成。将检测结果与临床血清样本检测进行对比，达到80%的准确率。因其便携、易用且准确，因此可用于疫情早期的大量样本筛查，作为临床血清检测等检测手段的有效补充[10]。

随着细菌感染的高患病率及全球抗生素耐药性的增加，如何早期确定病原菌成为临床实践中的一项日益紧迫和困难的任务。世界卫生组织(WHO)报告称，抗生素耐药性是一个主要的公共卫生问题，因此需要一种快速而准确的技术来对细菌感染进行检测。LFIA是一种对细菌进行快速诊断的理想技术。近年来，几种基于LFIA的试条被用于检测细菌感染，其目标是从致病菌、全细胞、DNA或生物标记物等范围内的分析特定的分析物[9]。Martina Zangheri等开发了一种基于智能手机集成的化学发光(CL)-侧向流动免疫分析(LFIA)方法的生物传感器，用于定量检测唾液皮质，检出限为0.3 ng/mL，定量分析范围为0.3～60 ng/mL[11]。

2.2 食品安全领域的应用进展

食品安全是全球卫生工作的重中之重。国外有团队将基于智能手机的检测应用于传统的LFIA技术，发明了一种便携式生物传感器，用于葡萄酒和速溶咖啡样品中赭曲霉毒素A(OTA)的定量检测，可迅速识别可疑食品批次，及早追查污染源头，从而大大改善食品安全[12]。国内亦有类似报道，姚帮本等利用胶体金侧向层析技术对多种蔬菜中腐霉利进行检测[13]。另有使用双重胶体试纸条检测法对牛乳中四环素和青霉素的检测[14]及有机磷农药残留的检测等[15]。

2.3 其他领域的应用进展

LFIA还应用于其他领域。据统计，近10年来，应用于农业领域的40%，其中LFIA主要用于检测植物病害。其次是工业产品或过程质量监测占22%。法医领域的应用达22%，如血液和非法物质检测及环境标本检测[3]。LFIA在文物研究和保护领域也得到了应用，可通过LFIA来检测文化遗产项目中的蛋白质物质[16]。或使用胶体金标记多克隆抗体的便携式免疫层析试条(ICS)对丝绸进行定性检测等[17]。

3 发展趋势

LFIA的简单、易用、便携等特性使其得到了广泛应用。但是，LFIA的广泛应用也存在着一定的潜在风险。非专业或未经培训的人员使用其可能会出现因操作失误或对结果的判读失误而造成相应的风险或损失。让LFIA结果更准确易读、操作更加简单将是LFLA的发展方向。

目前，大多数LFIA还只能用于定性诊断。未来的发展方向将是对分析物进行灵敏的定量检测，使用手机对测试结果进行定量判读将成为未来的重要趋势[12]。LFIA检测方法中，基于AuNPs及其衍生物的光学方法最有可能发展并成为最可行的快速诊断实验技术之一，因为其简单且容易集成在传统LFIA条带中。此外，使用具有较小热响应的基膜可以进一步提高热敏LFIA检测方法的检测极限。随着微型机电系统技术、光电光源和传感器技术的进步和智能手机等移动设备的使用，将促进LFIA向智能化方向发展。智能手机的无线网络连接能力使远程诊断成为现实，通过智能手机，检测结果可以在手机上显示、存档，并传输给初级保健医生或医疗中心，进行详细分析[18]。