Cu含量对磁控溅射Ti-Cu纳米复合涂层抗菌性能的影响*

2022-11-01程培雪刘剑楠王静静陈田田滕海森

功能材料 2022年10期

程培雪，马迅，李伟，刘剑楠，刘平，王静静，陈田田，杨旭，滕海森

(1. 上海理工大学材料与化学学院，上海 200093；2. 上海交通大学医学院附属第九人民医院，上海200011)

0 引言

随着种植技术的日趋成熟，种植修复已成为牙周疾病或外伤导致失牙的重要治疗手段。因此，对口腔种植材料的需求也在增加。而钛金属作为种植体的首选材料，具有良好的生物相容性和机械性能，但由于钛本身不具有抗菌性能，所以存在细菌感染发生率高等问题[1]。因此，通过对钛种植体表面改性处理，使其获得良好的抗菌性能具有十分重要的意义。

为了使钛植入体表面获得良好的抗菌性能，表面改性技术特别是涂层技术成为一种有效的策略。多种多样的涂层例如负载抗生素涂层[2]、抗粘附的涂层[3]、负载纳米抗菌涂层[4]等迅速发展。然而，负载抗生素具有疗效不稳定、释放速率难以控制、细菌产生耐药性等问题，而抗粘附涂层很难准确地评估其在体内临床条件下的有效性，因此在很大程度上限制了其应用[5]。相比之下,负载纳米抗菌涂层如金属系涂层的抗菌效果则更加稳定[6]。

铜作为金属系抗菌剂是人体所需的微量元素之一，而且价格低廉，适量的铜无细胞毒性，并且有一定的抗菌性能[7-9]，在医学领域作为抗菌剂引起越来越多的关注。制备纳米铜涂层的方法有很多，例如物理气相沉积法(PVD)、化学气相沉积法(CVD)、金属有机化合物热分解法、液相化学还原法、水热法等。其中磁控溅射作为物理气相沉积法具有所需设备少、成膜速率高且均匀性好，涂层与基体之间具有较强的结合力等优点[10]，在实际生产中应用较为广泛。

近年来铜抗菌材料的研究也受到了越来越多的关注。Liu等[11]针对纯Ti与Ti-Cu合金种植体做了对比，结果表明Ti-Cu合金对变形链球菌和牙龈卟啉单胞菌的抗菌效果更佳，并做了细胞的增殖和粘附实验，发现Ti-Cu合金的生物相容性与纯Ti类似。李慕勤等[12]在环境温度为50 ℃的情况下，在试样表面镀铜3 min，通过实验测试发现铜涂层的抗菌率达到98.3%，抗菌效果非常明显。Heidenau等[13]基于凝胶-溶胶法在Ti合金表面制备了Cu-TiO2涂层，抑制了表皮葡萄球菌在钛合金表面的增殖，且对大鼠结缔组织成纤维细胞的生长没有明显的影响。韦春贝等[14]利用双靶磁控溅射在不锈钢表面制备了TiN/Cu-Zn涂层，并研究了多层结构对膜层耐腐蚀性能和抗菌性能的影响。结果表明，Cu-Zn层比较薄时，膜层的耐腐蚀性能比较好，抗菌性能对TiN层厚度较为敏感；随着Cu-Zn层厚度的增加耐腐蚀性能显著下降，而当Cu-Zn层较厚时，抗菌性能对TiN层厚度不敏感，均具有良好的抗菌性能

Cu是动物和高等植物中必不可少的微量元素且具有良好的抗菌活性，然而，铜过量时又具有较高的毒性，影响正常细胞生长。因此，本文采用磁控溅射法在纯Ti表面制备不同纳米Cu含量的Ti-Cu复合涂层，研究纳米Cu含量对Ti-Cu复合涂层表面形貌、粗糙度、疏水性、细胞毒性和抗菌性能的影响，在符合生物安全材料标准的情况下提高钛种植体的抗菌性能。

1 实验材料和方法

1.1 样品制备与分组

本文利用磁控溅射仪(JGP-450，沈阳科学仪器有限公司)在纯Ti基体上制备Ti-Ag纳米复合涂层。选用直径50 mm，厚度3 mm，纯度99.99%的Ti靶和Cu靶，并切成6块，然后将不同块的Ti靶和Cu靶拼接成一个整体，使用该方法拼接成具有不同面积比的Ti-Cu复合靶，Cu∶Ti的比例分别为1∶99、2∶98、3∶97、4∶96和5∶95，如图1以5∶95为例。基体为纯Ti片，直径10 mm，厚度1 mm，用800#、1000#、1200#、1500#、2000#的耐水砂纸对Ti片进行抛光打磨至镜面，在超声震荡机内利用丙酮、无水乙醇以及去离子水进行超声清洗各20 min，然后自然晾干。

利用磁控溅射仪溅射之前，需对磁控溅射仪抽真空，直至真空度低于5×10-4Pa，通入Ar，设置压强，启辉，预溅射15 min左右，除去靶材表面残留的杂质。在溅射功率为40 W，溅射气压为0.8 Pa，氩气流量为30 mL/min下溅射1.5 min，制备不同Cu含量的Ti-Cu纳米复合涂层，实验流程图如图2。根据复合靶中Ti和Cu面积比的不同将涂层组分为Cu-1组、Cu-2组、Cu-3组、Cu-4组、Cu-5组。

图2 实验流程图Fig.2 Experimental flow chart

1.2 样品表征

使用场发射扫描电子显微镜(SEM，Quanta FEG450，FEI公司)观察样品的表面形貌；X射线衍射仪(XRD，D8 Advance，Bruker公司)分析样品物相，测量范围30～80°；采用原子力显微镜(AFM，Dimension Icon，Bruker公司)观察各组样品的三维形貌同时进行粗糙度的测量；使用界面张力测量仪(JC2000C1，上海中晨数字技术设备有限公司)进行水接触角的测量，用量角法测量样品不同位置的水接触角，每组分别测量5组平行数据，最后计算出每组数据的平均值，所有测试均在室温下进行。

1.3 体外细胞毒性试验

按照MEM培养基：马血清为9∶1的比例配制细胞完全培养基，所有样品均为固体，每组样品均用含量为75%的酒精棉球进行擦拭，然后用无菌去离子水对样品进行3次冲洗，最后将样品放置于37 ℃保温箱内进行烘干。将各组样品放入无菌平皿内并做好标记，转移至超净台(SW-CJ-2FD，上海笃特科学仪器有限公司)内，通过紫外线照射对样品进行2 h的杀菌，然后把样品放到新的无菌离心管内，同时做好标记。按照10 mL∶1 cm2的比例加入完全培养基，放入37 ℃ CO2恒温细胞培养箱(WIGGENSWCI-180，北京桑翌实验仪器研究所)72 h，制备成浸提液。此为母液，4 ℃保存备用。

选取对数生长期的小鼠成纤维细胞(L929，上海赛百慷生物)，进行细胞计数，调整细胞浓度，按照6×103/孔的比例在96孔板中进行接种。总共分为9个组别，依次为：空白对照组(纯高糖培养基)、阳性对照组(苯酚)、阴性对照组(聚乙烯)、Ti组、Cu-1组、Cu-2组、Cu-3组、Cu-4组、Cu-5组。在5%CO2，37 ℃恒温培养箱中培养过夜，培养24 h后丢弃上清液，按照100 mL/孔加入浸提液，在24 h、48 h、72 h后停止细胞的培养，避光条件下，每孔各加入10 mL CCK-8试剂(Invigentech，货号：IV08-100)，并于5%CO2，37 ℃恒温培养箱中培养2 h。通过酶标仪(TECAN，型号：SPARK 10M)检测细胞在450 nm处的吸光度值OD。根据式(1)计算细胞相对活力(relative growth rate，RGR)，根据表1判断样品的毒性等级和安全标准。

(1)

表1 细胞RGR判断其毒性等级与安全标准

1.4 外抗菌实验

该实验采用的细菌为具核梭杆菌，采用脑心浸液肉汤(BHI)琼脂平板培养，然后在标准厌氧条件下(80%N2、10%H2、10%CO2，37 ℃)培养24 h，传代、稀释培育后，选取浓度值为106CFU/ml菌液，备用。将前述制备的样品用75%的酒精棉球擦拭，然后用去离子水冲洗试件3遍，37 ℃保温箱内烘干。将各组样品经紫外线照射杀菌2 h后，转移到新的无菌平皿内并标记。将灭菌后的样品与具核梭杆菌共培养24 h后，置于1 mLPBS中，轻振使样品上粘附的细菌脱落，然后将菌液稀释105倍，接种于新的BHI琼脂培养基中并做好标记，将标记好的培养基放置于厌氧箱中，然后抽真空，充入CO2混合气，37 ℃恒温孵箱内厌氧培养48 h后，对具核梭杆菌进行拍照计数，通过计数结果计算各样品抗菌率。

(2)

式中：R为抗菌率，%；A为实验组样品平均回收菌落数，cfu/片；B为纯Ti对照组样品平均回收菌落数，cfu/片。

2 结果与讨论

2.1 不同Cu含量对Ti-Cu纳米复合涂层微观形貌的影响

不同Cu含量的Ti-Cu纳米复合涂层的SEM图如图3，由图3可见，Ti片表面比较光滑，而涂层组样品表面分布有纳米级颗粒。随着Cu含量的增加，Ti片表面颗粒也越来越多。图4为各涂层组样品的XRD图，从图中可知没有Cu相产生，说明Ti-Cu纳米复合涂层中Cu含量过少，且Cu的尺寸为纳米级别的，显示不出来。在衍射角2θ为76.1°附近出现了Ti的衍射峰。根据图4与标准图谱对照结果，可以得知为Ti(112)晶面。

图3 不同纳米Cu含量涂层的SEM图(a)Ti、(b)Cu-1、(c)Cu-2、(d)Cu-3、(e)Cu-4、(f)Cu-5Fig.3 SEM images of coatings with different nano Cu content: (a)Ti, (b)Cu-1, (c)Cu-2, (d)Cu-3, (e)Cu-4, (f)Cu-5

图4 不同纳米Cu含量涂层的XRD图谱Fig.4 XRD patterns of coatings with different nano Cu content

2.2 不同Cu含量对Ti-Cu纳米复合涂层粗糙度的影响

图5和图6分别为AFM分析的三维形貌和表面粗糙度。如图5所示，Ti组和涂层组的三维形貌有很大差别。Ti对照组表面如图5(a)比较光滑，无颗粒状结构。而涂层组表面被均匀分布的Ti/Cu颗粒所覆盖。由图6可知，纯Ti表面粗糙度Ra为1.12±0.18 nm，涂层组表面粗糙度Ra相对于纯Ti对照组有明显地增加，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。并且随着Ti-Cu涂层中纳米Cu含量的增加，涂层组的粗糙度也按照Cu-1、Cu-2、Cu-3、Cu-4、Cu-5的顺序依次在增加，粗糙度值分别为5.16±0.40 nm、8.45±0.90 nm、10.45±0.70 nm、13.70±0.80 nm、16.1±s0.75 nm，其中Cu-5组粗糙度最大。

图5 样品表面AFM形貌：(a)Ti, (b)Cu-1, (c)Cu-2, (d)Cu-3, (e)Cu-4, (f)Cu-5Fig.5 AFM morphology of sample surface: (a)Ti, (b)Cu-1, (c)Cu-2, (d)Cu-3, (e)Cu-4, (f)Cu-5

材料表面粗糙度是影响微生物粘附的一个主要因素[15]。粗糙的种植体表面有利于细菌粘附，而光滑的表面可以减少细菌粘附[16-18]。然而，近年来研究发现，表面粗糙度与细菌粘附[19]的数量并不是正相关的。Bollen等[20]研究了粗糙度与细菌粘附的关系，结果表明，Ra>0.2 μm时，表面粗糙度的增加可以促进细菌粘附，而Ra<0.2 μm时，细菌的粘附不随粗糙度的变化而变化。本实验中原子力显微镜(AFM)分析结果表明，涂层组表面的粗糙度虽然都有所提高，但所有样品的表面粗糙度均保持在0.2 μm以下，所以，本实验中各组样品的表面粗糙度对细菌粘附的影响不大。

图6 不同纳米Cu含量涂层的粗糙度Fig.6 Roughness of coatings with different Cu content

2.3 不同Cu含量对Ti-Cu纳米复合涂层疏水性的影响

图7为各样品的水接触角。一般认为，水接触角小于90°时该表面具有亲水性，表面自由能高；水接触角大于90°时该表面具有疏水性，表面自由能低[21-22]，植入材料的疏水性对细菌的粘附以及生物膜的形成都有一定的影响，尤其影响细菌在其表面的初始粘附。通常亲水性的表面比疏水性表面更有利于细菌粘附和增殖[23]。本实验中，由图7可知，对照组纯Ti的水接触角为80.67°±0.82°，与对照组相比，各镀Ti-Cu纳米复合涂层组样品表面的水接触角均增大，且差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。随着纳米Cu含量的增加，水接触角增加，Cu-1、Cu-2、Cu-3、Cu-4、Cu-5组涂层的水接触角分别为95.58±0.92°、98.17±0.62°、100.33±0.51°、103.17±0.85°、107.42±1.23°。

图7 不同纳米Cu含量涂层的水接触角Fig.7 Water contact angle of coating with different Cu content

2.4 不同Cu含量对Ti-Cu纳米复合涂层细胞毒性的影响

图8和表2分别是细胞吸光度值OD、RGR及细胞毒性等级结果。由图8可知，在24，48，72 h 3个时间点，纳米Cu涂层组、Ti组、阴性对照组的OD值与空白对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)，对比阳性对照组在所有时间点与其他实验组的OD值，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。

表2 各组L929细胞培养不同时间的RGR与细胞毒性等级

大量的研究表明，纳米Cu具有细胞毒性和遗传毒性。纳米Cu的细胞毒性受到多种因素的影响，例如纳米Cu的大小，形状，浓度等。通常纳米Cu的浓度越高，其细胞毒性越大，甚至可以导致细胞死亡。本实验通过CCK-8法检测各组样品的细胞毒性，结果表明，阴性对照组、Ti组和各纳米Cu涂层组细胞相对活力均大于90%，毒性等级为Ⅰ级，未表现出明显的细胞毒性，符合生物安全材料的标准。这是由于涂层组样品有较少的Cu，从而未表现出细胞毒性。

本实验结果表明抗菌结果表明，通过磁控溅射技术在纯钛表面沉积的Ti-Cu纳米复合涂层具有明显的抗菌作用，并且Cu含量越高，涂层的抗菌效果也越好。虽然人们对Cu的抗菌机制已经有长期的研究，但是关于其抗菌机制也没有统一定论，目前大家公认的主要有以下两种理论：

2.5 不同Cu含量对Ti-Cu纳米复合涂层抗菌性能的影响

图9为个样品表面细菌培养计数结果，如图9所示，经过一定时间的培养，样品表面的菌落在琼脂平板上生长。结果表明，细菌在Ti组样品表面存活良好，稀释后涂覆到平板中在培养基表面大量繁殖，培养基的表面出现大量菌落，表明Ti组表面没有杀菌作用。对应载Cu涂层组的培养基中菌落明显减少。样品的抗菌率见表3，以对照组Ti组的细菌存活率100%为标准，Cu-1、Cu-2、Cu-3、Cu-4、Cu-5组样品表面的抗菌率分别为83%、85%、 89%、93%和95%，表明Cu元素的加入使材料获得抗菌性能，且对具核梭杆菌具有较强的抗菌作用，随着纳米Cu含量的增高，抗菌效果也越好，Cu-5组抗菌率最高，达到95%。

图9 各样品表面细菌培养计数结果 (a)Ti、(b)Cu-1、(c)Cu-2、(d)Cu-3、(e)Cu-4、(f)Cu-5Fig.9 Counting results of bacterial culture on the surface of each sample: (a)Ti, (b)Cu-1, (c)Cu-2, (d)Cu-3, (e)Cu-4, (f)Cu-5

表3 具核梭杆菌菌落计数(±s，n=3)及抗菌率(%)Table 3 Colony count and antibacterial rate of Fusobacterium nucleate

(1)铜离子释放杀菌

铜离子表面带正电荷，对于细菌而言，细胞膜表面带负电荷。当受到静电引力作用时，铜离子很容易吸附在细菌细胞膜上，且一步步透过细胞壁穿入细菌内部，和相关的酶、蛋白质等产生一定的化学反应，进而达到破坏核酸和DNA合成的目的。通过以上过程铜离子可以干扰细菌的正常功能，影响其内部pH值，使其无法正常分裂繁殖，也即达到了消灭细菌或抑制细菌增殖的目的[24-25]。

(2)接触杀菌

有研究发现，含铜涂层中未析出的铜离子也会有一定的抑菌效果[26]。当细菌与材料表面的铜涂层接触时，涂层中含的铜离子和细菌表面发生反应，导致细菌的细胞膜破损，进而造成细菌停止呼吸，细菌活性丧失，进而完成杀菌或抑菌[27-28]。也有研究表明，接触式的杀菌与细菌细胞膜内部的不饱和脂肪酸的ROS催化反应有关，ROS可以干扰细菌生存所必需的一些基本成分活性，导致细菌死亡[29]。