基于sirtuins探讨卵巢早衰的发生机制*

2022-11-01李佳妮范晓迪马林纳

中国病理生理杂志 2022年10期

李佳妮，马堃，范晓迪，张涵，马林纳

（1中国中医科学院西苑医院，北京 100091；2中国中医科学院，北京 100700；3中国中医科学院西苑医院基础医学研究所，北京 100091；4天津中医药大学，天津 301617）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40 岁之前出现卵巢功能减退，临床表现为闭经、促性腺激素水平升高，伴有雌激素降低及围绝经期症状。目前POF 全球发病率约为1%，而中国为1%～3.8%，有逐渐上升趋势［1］。POF 不仅影响患者受孕率，还会增加女性心血管和骨质疏松等患病风险。POF 的发病机制尚不明确，可能与原始卵泡池储存不足、卵泡成熟障碍和闭锁加速有关，涉及遗传、免疫和线粒体异常等因素。sirtuins 能够调控原始卵泡发育，增加卵巢储备，应对氧化应激和促进线粒体生物合成，有望成为生殖医学中新型诊断标记和治疗靶点。本文对sirtuins改善卵巢功能和预防卵巢衰老的研究进展综述如下。

1 sirtuins概述

sirtuins是一类依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的脱乙酰酶，主要通过调节细胞内蛋白的乙酰化修饰水平，参与许多重要的生物学过程。哺乳动物sirtuins 包括SIRT1～SIRT7，具有不同的亚细胞定位和酶活性。SIRT1、SIRT6 和 SIRT7 主要存在细胞核中，SIRT3、SIRT4 和 SIRT5 主要定位于线粒体，SIRT2 则存在细胞质中，但它们在细胞活动过程中可以重新定位［2］。sirtuins 可催化多种NAD+依赖性反应，包括去乙酰化、脱酰基化和ADP-核糖基化，其功能及酶活性受细胞内NAD+浓度或NAD+/NADH 比值变化调节。sirtuins 不仅能够使组蛋白 H3、H4 和 H1 的赖氨酸残基去乙酰化，也对非组蛋白进行去乙酰化修饰，包括转录因子p53、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ 辅激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ co-activator-1α，PGC-1α），以及DNA 修复蛋白Werner 解螺旋酶、Ku70 和聚 ADP-核糖聚合酶 1［poly（ADP-ribose）polymerase 1，PARP1］等。

2 sirtuins参与POF发生发展的机制

2.1 sirtuins 延缓原始卵泡激活和闭锁原始卵泡数量反映了卵巢的寿命，原始卵泡过度激活和闭锁会加速卵泡耗竭，导致卵巢衰老，从而可能诱发POF。热量限制（calorie restriction，CR）可以增加原始卵泡数量，延缓成年小鼠卵巢功能衰竭［3］。相反，高脂饮食大鼠原始卵泡数目明显减少，闭锁卵泡数量增加，其卵巢中内源性SIRT1和SIRT6蛋白表达水平降低［4］。CR 增加卵巢储备的分子机制与上调sirtuins 表达有关［5］。在老龄和 POF 小鼠模型中，原始卵泡数量明显减少且SIRT1、SIRT3 和SIRT6 表达下调，而在CR小鼠中卵泡数量增加且这些sirtuins表达上调，表明sirtuins与原始卵泡数量呈正相关。因此，临床上可将SIRT1、SIRT3 和SIRT6 作为评估卵巢储备和生育力水平的潜在指标［6］。

卵泡发育成熟受抑制性和刺激性因子的双重调节，处于一个精密的动态平衡状态。研究表明，sirtuins 通过调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、叉头框蛋白O3a（forkhead box O3a，FOXO3a）和p53 在原始卵泡激活和闭锁中发挥重要作用。敲除小鼠Tsc1和Tsc2基因，mTOR 复合物 1（mTOR complex 1，mTORC1）呈现高表达同时原始卵泡过度激活，表明mTORC1 是促进卵泡发育的刺激性因子之一。高脂饮食能够抑制SIRT1 信号传导，进而上调mTOR 的表达，促使卵泡丢失，导致POF的发生。SIRT1激活剂SRT1720能够通过下调卵巢中mTOR 表达水平，增加原始卵泡数，改善卵巢储备［7］。FOXO3a 作为卵泡激活的抑制因子，在卵泡生长的早期发挥作用，减少原始卵泡的消耗［8］。研究显示CR 可能是通过上调SIRT1-FOXO3a-核因子E2 相关因子1（nuclear factor E2-related factor 1，NRF1）-SIRT6 信号来抑制卵泡激活，维持原始卵泡的休眠状态［5］。Sirt1基因敲入小鼠的阴道开口时间和第一次动情期均晚于野生型小鼠，免疫组织化学显示 SIRT1 和 FOXO3a 的表达增加［9］。此外，SIRT2 和SIRT3 也能够正向调节FOXO3a，增加卵巢储备。相反，sirtuins表达缺陷会减少卵泡数量，加速原始卵泡的耗竭［10］。

p53作为调控细胞凋亡的关键分子，诱导卵母细胞和颗粒细胞过度凋亡，促进原始卵泡闭锁。在POF大鼠卵巢组织中，观察到p53的mRNA 和蛋白表达上调［11］。通过瞬时转染过表达p53 能够增加卵母细胞凋亡率，表明p53 参与了原始卵泡闭锁的发生［12］。乙酰化是p53 介导发挥效应的重要修饰，可调节 p53 活性与稳定。SIRT1、SIRT2 和 SIRT3 表达的增加能够降低p53 乙酰化水平，抑制p53 功能，减少卵泡凋亡与闭锁，维持卵巢储备［13-15］。SIRT1 降低p53 转录活性是通过去乙酰化p53 C 端Lys382 位点，间接下调p53 下游细胞周期负调控因子p21 和p53上调的凋亡调节因子（p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）的表达［16］。p53是诱导凋亡的关键介导者，上调sirtuins 能够抑制p53 依赖的细胞周期阻滞和凋亡，减少卵泡闭锁。

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B通路也是启动原始卵泡激活的关键信号，sirtuins 和 PI3K 是否同时调控 mTOR 和FOXO3的表达尚未阐明。卵泡发育是一个高度协调且精密调控的生理过程，卵泡闭锁不仅只有凋亡参与，自噬也参与其中。尽管以上研究证实sirtuins 可通过调控卵巢衰老的关键基因及通路影响原始卵泡的激活与闭锁，但sirtuins、PI3K 及自噬之间如何共同调节原始卵泡池的数量，还需深入研究，为揭示POF的发生机制提供基础。

2.2 sirtuins 调节减数分裂纺锤体的组装和染色体分离纺锤体是卵母细胞减数分裂过程中重要细胞器，其结构和功能直接影响染色体的迁移和分离。当纺锤体组装错误且不断积累时，卵母细胞减数分裂受阻，逐渐停止发育，甚至启动p53 诱导的细胞凋亡信号通路，导致卵泡闭锁，加速卵巢衰老。与年龄相关的卵母细胞质量下降与减数分裂过程中纺锤体异常和染色体非整倍体增加有关。研究显示卵母细胞中纺锤体缺陷和染色体的错误分离是由于sirtuins的表达降低［17］。组蛋白H4 第 16 位赖氨酸残基（histone H4 lysine 16，H4K16）低乙酰化状态是维持卵母细胞中动粒功能的关键，高乙酰化的H4K16 可破坏着丝粒周围异染色质干扰动粒组装，损害动粒-微管之间的相互作用。敲除卵母细胞Sirt2将导致H4K16和α-微管蛋白超乙酰化，纺锤体缺陷和染色体分离异常，干扰减数分裂［18-19］。

在卵母细胞减数分裂中若纺锤体结构合成错误，纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint，SAC）会阻止染色体与异常纺锤体微管结合，延长细胞周期，直到纺锤体组装完成，保证染色体正确分配。纺锤体组装检查点蛋白BubR1（budding uninhibited by benzimidazole-related 1，BubR1）是 SAC 的核心部分，在监控微管动力学结构中发挥重要作用。小鼠BubR1低水平导致染色体排列紊乱并影响生殖功能，这可能与SAC 未能及时监控纺锤体组装导致减数分裂异常有关［20］。BubR1 低乙酰化对确保纺锤体正确组装具有重要意义。SIRT2 能够降低BubR1第243 位赖氨酸残基（BubR1 lysine 243，BubR1K243）的乙酰化水平，监控纺锤体组装，保证染色体分离，减少非整倍体卵子的发生［21］。

糖原合酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）在小鼠卵母细胞纺锤体极和动粒区域都有分布，能磷酸化MAP2C、MAP1B和tau等微管相关蛋白，调节微管动力学和稳定性［22］。SIRT3 能够使 GSK3β第15位赖氨酸残基（GSK3β lysine 15，GSK3βK15）去乙酰化而增强其活性，调控微管动粒和纺锤体组装，减少卵母细胞减数分裂缺陷的发生［23］。此外，将来自Sirt3基因缺陷小鼠的卵母细胞用于体外受精，受精率和成胚率明显降低，并且胚胎植入率和胎儿生长速率均下降［24］。sirtuins表达下调增加了胚胎发育缺陷和流产风险，其可能与调节微管动粒和纺锤体组装蛋白乙酰化水平增加有关。

组蛋白乙酰化状态在卵母细胞发育成熟的不同阶段是动态变化的，减数分裂过程中发生的去乙酰化对于染色体的分离、受精及胚胎发育至关重要。通过去乙酰化 H4K16、BubR1 和 GSK3，sirtuins 调控细胞分裂中纺锤体组装和染色体分离，保护卵母细胞发育成熟，减少染色体非整倍体产生及胚胎发育异常。与年龄相关的组蛋白去乙酰化不足导致MII期卵母细胞呈高乙酰化状态，这可能是高龄女性卵母细胞发生高频染色体非整倍分裂的重要原因。

2.3 sirtuins 参与DNA 损伤修复卵母细胞DNA 损伤修复能力在减数分裂和卵泡发育的过程中维持基因组的稳定。当DNA 损伤得不到及时有效修复，将导致减数分裂联会过程受阻，卵泡数目下降，从而可能诱发POF的发生。特异性Sirt7敲除小鼠的胚胎在发育后期或出生后的第一个月死亡，表现出早衰表型，这可能与SIRT7缺失导致DNA 双链断裂修复受损有关［25］。DNA 双链断裂时，SIRT7 以依赖 PARP1的方式被募集到DNA 损伤位点，使组蛋白H3 第18位赖氨酸残基（histone H3 lysine 18，H3K18）乙酰化水平降低，增加DNA 损伤反应因子p53 结合蛋白1（p53-binding protein 1，53BP1）在受损部位的聚集，募集DNA 损伤修复蛋白，增加非同源末端连接（nonhomologous end-joining，NHEJ）DNA 修复效率［26］。在DNA 修复过程中，SIRT6 也被募集到损伤位点，使组蛋白 H3 第 56 位赖氨酸残基（histone H3 lysine 56，H3K56）和组蛋白 H3 第 9 位赖氨酸残基（histone H3 lysine 9，H3K9）去乙酰化，募集ATP 依赖的染色质重塑因子SNF2H（sucrose nonfermenting 2 homolog），稳定DNA 双链断裂修复因子DNA 依赖性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK），促进损伤修复［27-28］。此外，SIRT1 和 SIRT6 还可以调节端粒延伸所需的端粒逆转录酶的表达，保持端粒的结构稳定和基因完整性［29-30］。SIRT4 通过调节线粒体谷氨酰胺代谢在DNA损伤中发挥作用［31］。

在卵母细胞发育过程中，sirtuins 通过选择性去乙酰化组蛋白H3K18、H3K56和H3K9参与染色质重构，促进53BP1、PARP-1、Ku70 和Werner 蛋白募集至DNA 损伤位点发挥修复作用，同时调控修复蛋白，抑制端粒磨损，维护卵母细胞基因组的稳定性。在DNA 损伤修复过程中，sirtuins 的研究有利于深入探讨卵巢衰老及POF 基因突变的机制和原因。然而，组蛋白乙酰化修饰在卵母细胞发育成熟过程中是动态变化的，改变卵母细胞的乙酰化对其后代表型的影响也是未知的，这些因素增加了sirtuins 在卵巢衰老领域开发药物的难度和复杂性。

2.4 sirtuins 拮抗卵母细胞氧化应激维持自由基-抗氧化体系的动态平衡是卵巢行使内分泌和生殖功能的保障，在卵巢中适量的氧自由基能够促进卵泡发育，长期过度的氧化应激会导致卵泡闭锁［32］，降低卵母细胞数量和质量，加速卵巢衰老。sirtuins 能够调控抗氧化酶的活性，清除过量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），提高卵母细胞抗氧化能力。褪黑素是一种非酶类抗氧化物质，研究显示褪黑素通过增加SIRT1的表达降低老龄鼠中ROS水平，提高卵母细胞总抗氧化能力，增加ATP 含量，改善卵母细胞发育［33］。相反，使用 SIRT1 选择性抑制剂 Ex527 处理后，卵母细胞中的ROS水平升高，且减数分裂后期纺锤体和染色体错位异常增加［34］。在不孕女性患者中观察到，SIRT1基因变异（rs10509291 和 rs12778366）的频率明显升高，SIRT1表达下调降低了锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）水平［35］。在氧化应激刺激下，SIRT1通过去乙酰化激活FOXO3a，活化的FOXO3a易位进入细胞核，通过直接与MnSOD启动子结合增加MnSOD 蛋白的表达来抵抗ROS，从而保护细胞免受氧化应激［36］。

随着年龄的增长，超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）乙酰化水平逐渐增加，SOD2抗氧化酶活性与其乙酰化水平呈负相关。过量的ROS会增加MII 期卵母细胞中纺锤体缺陷和染色体排列紊乱，降低细胞体外成熟率和囊胚形成率。SIRT3能够通过调节 SOD2 来调控抗氧化系统［37-38］。Sirt3敲除的卵母细胞中ROS 水平明显增加，SOD2 第68 位赖氨酸残基（SOD2 lysine 68，SOD2K68）乙酰化水平升高，槲皮素通过激活SIRT3 能够逆转这一现象［39］。SIRT3 能够直接去乙酰化SOD2K68，上调抗氧化酶活性，平衡卵母细胞ROS水平，对卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中的氧化应激起保护作用。

抗氧化酶表达水平下降，持续和/或过量的自由基生成刺激会对卵巢造成累积性损伤，导致卵泡发育异常，从而加速卵巢功能的衰退，引发POF。SIRT1 和SIRT3 可通过直接去乙酰化上调抗氧化酶表达或激活转录因子诱导抗氧化程序，增加抗氧化酶活性，加速ROS的清除，平衡卵母细胞氧化还原状态，减轻氧化损伤，保持卵巢内环境稳态。sirtuins可作为抗氧化剂清除多余的自由基，保护女性卵巢储备和功能，但对于POF患者，sirtuins单药治疗或作为辅助用药的效果如何仍需要确切的临床试验证据。同时，sirtuins的使用须警惕“还原应激”的发生，用药时机和剂量的把握也是评估其临床有效性和安全性需要考虑的重点和难点。

2.5 sirtuins 促进线粒体生物发生卵母细胞成熟和排卵过程中染色体移动需要消耗大量的能量，其能量主要由线粒体产生的ATP 供给。线粒体的结构和数量并非静态不变，而是由线粒体生物发生和线粒体自噬功能调控使线粒体数量达到动态平衡，以满足机体不同阶段的能量需求。线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）拷贝数下降会引起线粒体数量减少，导致卵母细胞线粒体功能障碍，影响染色单体分离，增加非整倍体发生。PGC-1α 作为线粒体重塑和生物发生的主要转录调节因子，能够促进核基因和mtDNA 转录来协调线粒体生物合成。PGC-1α的活性受翻译后修饰调节，SIRT1能够去乙酰化上调PGC-1α 活性［40-41］。活化后的PGC-1α 进入细胞核，激活NRF1和NRF2，诱导编码线粒体蛋白的基因表达，继而激活线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM），增强mtDNA 复制，调控线粒体数量和功能以响应机体能量需求［42-43］。

因此，sirtuins 能够去乙酰化调控PGC-1α 活性，促进线粒体生物发生和氧化磷酸化，增加mtDNA 拷贝数，为卵母细胞发育成熟过程中纺锤体分布和染色体排列提供能量。目前仅有少数研究证明sirtuins激动剂能够减轻卵母细胞因能量不足引起的发育成熟障碍，因此有待更多体内体外的研究来充分验证sirtuins 在线粒体功能中的保护作用，揭示线粒体生物发生在卵巢中的作用机制和关键靶点，探寻安全有效的sirtuins 激活剂，为POF 和生育力低下的女性提供新的治疗策略。

3 总结

卵巢是女性重要的生殖内分泌器官，卵巢功能衰退直接影响女性多系统的健康。POF 是导致女性不孕症的主要原因，且发病呈年轻化趋势。引起特发性POF 的原因仍未明确，许多患者与遗传、自身免疫、医源性因素等有关。POF 的发病机制尚未阐明，未来还需要进一步对卵泡发育成熟的过程进行探索，揭示POF 发生发展的机制，为改善卵母细胞质量和发育潜能提供新的思路。对于POF，临床主要采用激素替代治疗和辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）。卵母细胞冷冻是ART中用于女性生育力保存的方法之一，研究显示玻璃化冷冻会减少 mtDNA 拷贝数［44］，降低线粒体酶活性［45］，增加ROS水平，损伤卵母细胞线粒体功能，导致受精和胚胎发育能力低下［46］。临床上，接受ART 治疗的患者也存在卵巢低反应和周期取消情况，其根本原因在于卵母细胞质量的下降。ART 虽一定程度可提高POF 的妊娠率，但无法从根本上改善患者的卵巢功能，即使成功妊娠，后期还会有胚胎停育的风险。

年龄是影响女性生育力及妊娠结局的独立危险因素，随着生育年龄的推后，优生优育是保证国家人口素质的关键，目前尚无最佳的用药方案，缺乏有效药物和治疗方法从根本上改善卵巢功能，因此探寻安全可靠的药物来提高卵母质量是未来的研究方向。多项研究表明，sirtuins能够改善卵巢功能，保护女性生殖健康，包括延缓原始卵泡过度激活和闭锁、调节卵母细胞成熟过程中纺锤体的组装和染色体分离等（表1）。另外，sirtuins通过增加卵母细胞和胚胎中mtDNA 数量和ATP 含量，提高解冻胚胎的存活率，改善胚胎移植（embryo transplantation，ET）后的妊娠结局［47-49］。sirtuins 有望成为改善和预防 POF 的潜在靶点，以sirtuins 为靶点的作用药物未来可作为ART 预处理方案，减少因冷冻引起的线粒体损伤，从而提高体外成熟卵母细胞的低温耐受性和发育潜能。目前对卵巢细胞中sirtuins表达水平及其精密调节机制的研究尚不深入，未来的研究将进一步揭开组蛋白修饰在POF 发生中的作用。此外，sirtuins 激活药物大多还停留在细胞和动物实验，还需进一步深入研究，后续可通过多中心、大样本、多阶段的临床试验来提供证据支持，为sirtuins 对卵巢衰老的防治提供更多科学依据。