IGF1R敲除通过AMPK减轻Ang II诱导的小鼠心肌炎症及细胞凋亡*

朱家峰， 李 倩， 方 柳， 姚 倩， 张侍玉， 张兰娥△

（1潍坊医学院护理学院，山东 潍坊 261053；2潍坊医学院临床医学院，山东 潍坊 261053）

随着社会经济发展和人口老龄化的加剧，心血管危险因素对人类健康的影响愈加显著，心血管疾病（cardiovascular diseases，CVD）是全球范围内影响发病率和死亡率的主要原因［1］，也是首位死亡原因［2］。在过去 20 年（1997～2018 年），全球 CVD 的死亡率几乎没有变化，尤其心力衰竭（心衰）更是如此，其 5 年死亡率仍然高达 45%～55%［3］。目前，我国CVD 患病率仍处于持续上升阶段，现有患病人数大约3.3 亿，是主要的死亡原因，其中农村为46.66%，城市为43.81%。因此，CVD 已成为一个日益严重的全球性公共卫生问题，防治工作刻不容缓［4］。

高血压是CVD 的关键危险因素，而持续高血压会导致心脏功能下降和严重的心脏损伤。血管紧张素II（angiotensin II，Ang II）是肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）的关键组成部分，介导高血压心脏损伤［5］和炎症细胞/巨噬细胞浸润；并且，RAS 影响心肌细胞内过程，包括促炎细胞因子和活性氧的产生增加、纤维化、肥大、细胞凋亡、内质网应激等［6-7］。Yang 等［8］发现，减少心肌炎症反应和凋亡会减轻Ang II 诱导的小鼠心脏损伤和重构的进展，改善心功能。AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）活化能够调节心脏代谢和炎症反应，从而保护小鼠心脏免受缺血性损伤［9］。因此，如何抑制Ang II 诱导的心肌炎症反应及细胞凋亡是治疗及预防心肌损伤和重构的重要方向。

胰岛素生长因子1 受体（insulin growth factor 1 receptor，IGF1R）是一种酪氨酸激酶，在心脏中广泛表达，具有调节心脏收缩功能和细胞增殖分化的重要生理作用［10］。有研究表明，IGF1R 在小鼠心脏中的过表达最终导致收缩性能的下降和间质纤维化的增加，并且IGF1R 在小鼠缺血性心脏病和心力衰竭中过表达［11-12］。然而，有研究在雌性小鼠中使用IGF1R 单克隆抗体有效改善了心脏功能［13］。因此本研究利用Ang II 诱导小鼠高血压心脏损伤，旨在探讨IGF1R缺失对Ang II 诱导的小鼠心肌炎症反应和心肌细胞凋亡的影响及其作用机制。

材料和方法

1 动物

SPF 级、6～8 周龄雄性野生型（wild-type，WT）C57BL/6 小 鼠 和 杂 合 子Igf1r基 因 敲 除（Igf1r+/-）C57BL/6小鼠（体重22～24 g）各20只购自赛业（广州）生物科技有限公司［许可证号SCKX（粤）2018-0032］，饲养在潍坊医学院动物实验中心，进行温度、湿度控制和12 h 的光-暗循环。动物实验根据山东省人民政府出版的《实验动物护理和使用指南》和《实验动物护理和使用指南》进行。动物实验经潍坊医学院动物护理与使用委员会批准（No. 2020SDL163）。

2 主要试剂

Ang II购自上海索莱宝生物科技有限公司；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase-MB，CK-MB）和心肌钙蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）的ELISA 检测试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。TRIzol 试剂购自 Invitrogen；逆转录 Ace®qPCR RT 试剂盒和SYBR®Green 购自Toyobo；所用引物由上海生工生物工程有限公司根据设计合成，序列见表1。抗 IGF1R、caspase-3、caspase-8、AMPK 和 p-AMPK 单克隆抗体均购自Cell Signaling Technology；抗GAPDH单克隆抗体购北京中杉金桥生物技术有限公司；羊抗兔Ⅱ抗和羊抗鼠Ⅱ抗均购自Proteintech。

3 主要方法

3.1 小鼠模型及实验分组 研究表明，Ang II 皮下注射2 周可以诱导小鼠心脏损伤和心肌重构［14］，因此本研究对Ang II 组小鼠皮下注射Ang II（2 mg·kg-1·d-1）2 周以构建心肌损伤模型。将 WT 和Igf1r+/-小鼠各20 只按照随机数字表法各分为2 组，共4 组，即 WT+saline 组、WT+Ang II 组、Igf1r+/-+saline 组和Igf1r+/-+Ang II 组，每组 10 只。saline 组小鼠皮下注射等体积的生理盐水2周。

3.2 小鼠心功能测定 在4 组小鼠连续处理2 周后，禁食禁水8 h 测量体重（body weight，BW）并以3%异氟烷麻醉小鼠，快速进行眼球取血后用二氧化碳安乐处死小鼠，然后对心脏重量（heart weight，HW）和胫骨长度（tibial length，TL）进行测量。

3.3 免疫组织化学法检测IGF1R 在心脏组织中的表达 收集WT 和Igf1r+/-小鼠心脏进行固定、包埋，利用免疫组织化学法分别检测心脏组织样本IGF1R的表达情况。IGF1R 定位于细胞质，以棕黄色颗粒为染色阳性。ImageJ 图像分析软件对染色结果进行分析和定量。

3.4 ELISA 检测炎症因子 将4 组小鼠血液4 ℃静置 24 h 后，3 000×g离心 15 min 收集血清，按 ELISA试剂盒说明书检测血清中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平，将10 μL样品（用40 μL样品稀释剂按1∶5的比例稀释）加入到ELISA 涂层板上的相应孔中，然后加入100 μL HRP 偶联试剂。仅在空白孔中加入样品稀释剂。密封后，在37 ℃下孵育60 min。用洗涤液冲洗 5 次后，每孔依次加入 50 μL 显色剂 A 和 50 μL 显色剂B，37 ℃黑暗孵育15 min。最后，用 50 μL 终止液在室温下终止反应5～10 min，用酶标仪测定450 nm 波长的吸光度，根据不同ELISA 试剂盒的方法计算出炎症因子的浓度。

3.5 TUNEL 检测心肌组织中细胞凋亡 取小鼠心脏标本，PBS 冲洗干净后，4%多聚甲醛固定，用组织刀片沿水平45°进行横切后，进行石蜡包埋和制作5 μm 厚石蜡切片。然后将各组心肌组织切片室温下用二甲苯和梯度乙醇溶液（二甲苯10 min，二甲苯8 min，100%乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，70%乙醇，蒸馏水2 min）脱蜡。样品与20 mg/L蛋白酶K（无DNase）在37 °C 下孵育15 min。切片用PBS 洗涤 3 次后，用 TUNEL 反应溶液在 37 °C 下孵育1 h。切片用抗荧光衰退剂（含DAPI）密封，然后再用PBS 冲洗。在荧光显微镜下观察和拍照，细胞凋亡率：凋亡细胞与总细胞的比值。

3.6 RT-qPCR 用TRIzol 试剂从小鼠左心室中获得总RNA，用逆转录Ace®qPCR RT试剂盒将RNA转化为cDNA。以引物为起始位点，在SYBR®Green 作用下，采用LightCycle 480 Instrument II PCR 检测仪（Roche）进行PCR 扩增。反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，40 个循环；72 ℃延长 10 min。内参照为 β-actin，结果使用 2-ΔΔCt方法进行分析。

3.7 免疫印迹法 四组心脏组织加入RIPA 裂解缓冲液、蛋白酶和磷酸酶抑制剂。将加入裂解液的组织在冰上轻轻搅拌 40 min，4 ℃、12 000×g离心 15 min 后收集上清液。用BCA 检测试剂盒（Thermo）测定蛋白样品的浓度，并在95 ℃下与加载缓冲液孵育10 分钟。对分子量大于10 kD 的蛋白质进行10%的Tris-Tricine-SDS-PAGE 电泳，并将蛋白质转移到PVDF 膜中。在室温下，用5%脱脂牛奶和Tris 缓冲盐水/Tween-20（pH 7.4）封闭细胞膜1 h，加入Ⅰ抗4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，每次10 min，使用相应Ⅱ抗常温孵育1 h，使用化学发光辣根过氧化物酶底物可视化蛋白条带，利用Alpha化学发光凝胶成像系统FluorChem FC3 获取条带，并ImageJ 图像分析软件测量蛋白条带灰度值进行定量。

4 统计学处理

采用 SPSS 19.0 和 GraphPad Prism 9.0 进行统计分析和图表绘制。数据均采用均数±标准差（means±SD）表示。两组样本之间采用独立样本t检验；多组之间差异使用双因素方差分析，然后采用LSD 法检验进行多重比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Igf1r基因敲除小鼠的构建

为了研究IGF1R 信号是如何调节Ang II 诱导的心脏重构，使用CRISPR/Cas9 基因敲除技术构建Igf1r基因敲除小鼠，见图1A。从小鼠尾巴中获得的总RNA，通过PCR 方法鉴定出Igf1r+/-小鼠，见图1B。通过免疫组织化学检测法检测IGF1R 在心脏中的表达，Igf1r+/-小鼠的IGF1R 阳性表达量显著低于WT 小鼠（P＜0.01），见图1C。

2 IGF1R敲除缓解Ang II诱导的小鼠心肌损伤

Figure 1. Establishment and analysis of insulin growth factor 1 receptor（IGF1R）gene knockout mice. A：protocols of Igf1r+/- mouse model generation. The CRISPR/Cas9 gene technology was used to selectively knock out mouse Igf1r gene. Through in vitro transcription，Cas9-mediated mRNA and generated gRNAs were injected into mouse zygotes to knock out exons 3 to 20 of the target gene Igf1r. B：identification of the genotype in Igf1r+/- mouse model by PCR. C：immunohistochemical staining of IGF1R in the heart of WT and Igf1r+/-mice（scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs WT group.图1 IGF1R敲除小鼠的构建和分析

在本研究中，Igf1r+/-和WT 小鼠皮下注射Ang II（2 mg·kg-1·d-1）2 周，实验方案如图 2A 所示。如表 2所示，各组小鼠BW 无显著差异（P＜0.05）；与WT+saline 组相比，WT+Ang II 组小鼠 HW 显著增加（P＜0.01），与 WT+Ang II 组相比，Igf1r+/-+Ang II 组小鼠HW 显著减少（P＜0.01）；心脏功能重要评价指标HW/BW 和HW/TL 也出现了相一致的结果。采用RT-qPCR 法检测各组小鼠心脏组织脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）的 mRNA 表达水平，结果显示，与WT+saline组相比，WT+Ang II组小鼠心脏BNP表达水平显著升高（P＜0.01）；与WT+Ang II 组相比，Igf1r+/-+Ang II 组小鼠心脏BNP 表达水平显著降低（P＜0.01），见图2B。采用ELISA 法检测各组小鼠血清cTnT和CK-MB含量，结果显示，与WT+saline 组相比，WT+Ang II 组小鼠血清 cTnT 和 CK-MB 含量显著增加（P＜0.01）；与WT+Ang II 组相比，Igf1r+/-+Ang II组小鼠血清cTnT和CK-MB含量显著减少（P＜0.05），见图2C、D。采用免疫印迹法检测各组小鼠心脏IGF1R 蛋白表达水平，结果显示，与WT+saline 组相比，WT+Ang II组小鼠心脏IGF1R蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与WT+Ang II 组相比，Igf1r+/-+Ang II组小鼠心脏IGF1R 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），见图2E。

表2 各组小鼠心脏指数Table 2. Cardiac indexes of the mice in each group（Mean±SD. n=10）

3 IGF1R 敲除降低Ang II 诱导的小鼠心脏组织炎症因子水平

通过RT-qPCR 法检测各组小鼠心脏组织中炎症因子 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的 mRNA 表达水平，结果显示，与 WT+Ang II 组相比，WT+Ang II 组小鼠心脏组织中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的 mRNA 表达水平均显著升高（P＜0.01）；与WT+Ang II 组相比，Igf1r+/-+Ang II 组小鼠心脏组织中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的 mRNA表达水平均显著降低（P＜0.01），见图3A。再通过ELISA 法检测各组小鼠血清中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6蛋白水平，结果显示，与WT+Ang II 组相比，WT+Ang II 组小鼠血清中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平均显著升高（P＜0.01）；与WT+Ang II 组相比，Igf1r+/-+Ang II 组小鼠血清中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平均显著降低（P＜0.01），见图3B。

4 IGF1R 敲除减少Ang II 诱导的小鼠心肌细胞凋亡

TUNEL 染色结果显示，与WT+Ang II 组相比，WT+Ang II 组小鼠心肌细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）；与WT+Ang II组相比，Igf1r+/-+Ang II组小鼠心肌细胞凋亡率显著降低（P＜0.01），见图4A。免疫印迹结果显示，与 WT+Ang II 组相比，WT+Ang II 组小鼠心脏组织中caspase-3 和caspase-8 表达水平显著升高（P＜0.01）；与WT+Ang II 组相比，Igf1r+/-+Ang II组小鼠心脏组织中caspase-3 和caspase-8 表达水平显著降低，见图4B。

5 IGF1R 敲除通过促进AMPK 磷酸化减轻Ang II诱导的心脏损伤

免疫印迹结果显示，与WT+Ang II 组相比，WT+Ang II 组小鼠心脏组织中AMPK 磷酸化水平显著降低（P＜0.01）；与WT+Ang II 组相比，Igf1r+/-+Ang II 组小鼠心脏组织中AMPK 磷酸化水平显著升高（P＜0.05），见图5。

Figure 2. The expression of insulin growth factor 1 receptor（IGF1R）was up-regulated in the peocess of angiotensin II（Ang II）-induced cardiac injury. A：the myocardial injury model was established by subcutaneous injection of Ang II（2 mg·kg-1·d-1）for 2 weeks，while the mice in control group were subcutaneously injected with the same volume of normal saline for 2 weeks；B：the mRNA expression level of brain natriuretic peptide（BNP）in mouse cardiac tissues was detected by RT-qPCR（n=6 to 8）；C and D：the serum levels of cardiac troponin T（cTnT）and creatine kinase-MB（CK-MB）in mice were measured by ELISA（n=6）；E：the protein expression of IGF1R in mouse cardiac tissues was detected by Western blotting（n=4）. Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs WT+saline group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs WT+Ang II group.图2 IGF1R在Ang II诱导的心脏损伤过程中表达上调

Figure 3. Insulin growth factor 1 receptor（IGF1R）knockout attenuated angiotensin II（Ang II）-induced cardiac inflammation. A：the mRNA expression levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-1β（IL-1β）and IL-6 in mouse cardiac tissues were detected by RT-qPCR（n=6 to 8）；B：the serum levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 in mice were detected by ELISA（n=6）. Mean±SD.**P＜0.01 vs WT+saline group；##P＜0.01 vs WT+Ang II group.图3 IGF1R敲除可减轻Ang II引起的心脏炎症

Figure 5. Insulin growth factor 1 receptor（IGF1R）knockout attenuated angiotensin II（Ang II）-induced cardiac injury by promoting AMP-activated protein kinase（AMPK）phosphorylation. The protein levels of phosphorylated AMPK（p-AMPK）and AMPK were detected by Western blotting. Mean±SD. n=3 to 4.**P＜0.01 vs WT+saline group；#P＜0.05 vs WT+Ang II group.图5 IGF1R敲除通过促进AMPK磷酸化减轻Ang II诱导的心脏损伤

讨 论

心脏损伤引发重构的发病机制复杂，主要包括心肌细胞肥大、纤维化、炎症反应和氧化应激等。在心血管疾病（如心肌缺血损伤、冠心病、心力衰竭和动脉粥样硬化等）发生过程中常常伴随着炎症反应。心肌细胞受到氧化应激刺激后，会产生炎症因子，过量的炎症因子会使细胞出现生长异常、自噬和凋亡的失调，导致细胞异常凋亡［15-16］，从而引起心脏损伤，甚至出现心力衰竭。因此，如何减少氧化应激、心肌炎症反应和细胞凋亡对缓解心肌损伤至关重要。最近，有关IGF1R 信号通路参与心血管疾病（包括心脏纤维化［17］、缺氧损伤［18］、心肌重构和糖尿病心肌病［19］）逐渐成为研究热点。IGF1R 信号在心血管系统中具有控制细胞生存、分化、细胞凋亡和炎症作用［20］。但是IGF1R 在不同类型的心脏疾病中可能发挥不同作用。Huynh 等［21］的研究表明，小鼠 IGF1R过表达能够通过激活AKT通路减少心肌梗死和凋亡来抑制糖尿病心肌病的发生。而Takeda等［22］在高血压心肌肥厚小鼠模型中却检测到IGF1R 高表达并且能够促进成纤维细胞增殖，增加心脏纤维化。为了进一步了解IGF1R 信号通路与心血管疾病的关系，因此本研究探讨了IGF1R 与心肌损伤之间的关系并明确了其作用机制。本研究观察到IGF1R 在Ang II诱导的小鼠心脏损伤过程中表达显著上调，这与既往研究在缺血性心脏病和心力衰竭时IGF1R 表达显著升高［12］的结果一致。心脏损伤时伴有心肌细胞的代偿性肥大和心室的扩大，所以Ang II 刺激WT 小鼠后导致 HW、HW/BW 和 HW/TL 显著升高，而Igf1r+/-小鼠给予Ang II 刺激后并没有引起上述观察指标的变化。心肌细胞损伤后，细胞膜被破坏，细胞产生的心肌损伤特异性标志物CK-MB 和cTnT 会在血液循环中升高［23］；并且心脏功能的重要指标BNP 的表达也会增加。我们继续观察到，Ang II 刺激的WT 小鼠心脏组织中BNP及血清中CK-MB和cTnT显著升高，而Igf1r+/-小鼠中Ang II诱导的心脏损伤明显减轻，表明敲除IGF1R能够缓解Ang II 诱导的小鼠心功能损伤。

炎症反应是导致心脏损伤和重构的一个关键生物学过程，并且IGF1R 在炎症过程的启动中起着重要作用。既往研究显示，Ang II能诱导巨噬细胞和小鼠心肌组织炎症小体的激活以及炎症因子（如TNF-α、IL-1β 和IL-6）释放［24］，这些炎症因子的表达量越高，说明组织炎性损伤的情况越严重，从而促进心功能损伤。本研究显示，Ang II 刺激WT 小鼠后导致炎症因子TNF-α、IL-1β 和IL-6均显著升高，而Ang II刺激的Igf1r+/-小鼠心肌组织炎症因子水平显著下降，表明IGF1R缺失抑制了心肌炎症。

在Ang II 诱导的心肌损伤中，心脏炎症反应可激活凋亡信号通路，主要通过内在途径（线粒体）和外在途径（受体介导）来促进心肌细胞凋亡。caspase蛋白家族广泛参与细胞凋亡，其中caspase-3 和caspase-8是凋亡的关键执行蛋白：caspase-8是由肿瘤坏死因子受体家族所诱导的，受到Fas外在途径凋亡通路影响［25］；caspase-3 可以通过内在途径（线粒体）诱导细胞凋亡［25-26］。所以 caspase-3 和 caspase-8 表达越高说明细胞凋亡越多。本研究检测到Ang II 刺激WT 小鼠导致caspase-3 和caspase-8 表达显著增加，表明出现了Ang II诱导了严重的细胞凋亡，但是Ang II刺激的Igf1r+/-小鼠心肌细胞凋亡率显著下降，表明IGF1R敲除能够缓解Ang II 诱导的心肌组织凋亡。此外，本研究通过TUNEL 染色检测细胞凋亡情况也得到了一致的结果。

AMPK 广泛存在于心肌细胞中，是能量代谢调节的关键分子，在生理和病理情况下都发挥着重要的功能。当心肌发生损伤时，心肌细胞中ATP 的浓度降低，激活AMPK。AMPK 激活可以减少促炎细胞因子TNF-α 的表达，发挥抗炎、抗氧化的作用，并可以抑制蛋白合成，减轻内质网应激而抑制心肌细胞凋亡，从而对心脏起到一定的保护作用［27］。有研究表明，抑制IGF1R 表达可减轻程序性细胞死亡和炎症，从而缓解心肌重构［28］。但是，关于抑制IGF1R 表达是否通过激活AMPK 途径减轻心肌损伤，目前尚未见到报道。为进一步阐明IGF1R缺失是如何抑制心脏炎症反应和细胞凋亡而发挥保护心脏作用的，我们利用免疫印迹法检测了各组小鼠心肌组织中AMPK 磷酸化水平的变化。结果显示，Ang II 刺激WT 小鼠可导致其心肌组织中p-AMPK/AMPK 比值显著降低，而Ang II 刺激的Igf1r+/-小鼠心肌组织中p-AMPK/AMPK 显著升高，表明IGF1R敲除可能通过促进AMPK 磷酸化来抑制心肌损伤中的炎症反应和细胞凋亡，进而对心肌组织起到保护作用。

综上所述，本研究显示IGF1R敲除可减轻Ang II诱导的小鼠心肌损伤，并通过抑制心肌炎症反应和心肌细胞凋亡来发挥作用，其作用机制可能与促进小鼠心肌组织中AMPK 磷酸化有关。但关于IGF1R在Ang II 诱导的心肌损伤中发挥作用的具体分子机制仍需要研究。