瑶药白九牛生药学研究

广西中医药大学药学院，广西 南宁 530200

瑶族在广西是仅次于壮族人口的第二大少数民族，瑶族先民在生产生活实践中发展壮大了瑶医药，因此在广西研究瑶药具有一定的地理优势。在传统瑶药中，最具特色的是瑶医老班药“五虎、九牛、十八钻、七十二风”，白九牛属于“九牛”之一，其名称“白九牛”始载于《中国瑶药学》[1]。瑶药白九牛，瑶语名“别坐翁”，别名七叶莲、那藤、牛藤、七叶那、五叶风、七姐妹、野木瓜等，为木通科野木瓜属植物五指那藤StauntoniaobovatifoliolaSubsp.intermedia(Y.C.Wu) T.Chen的干燥藤茎，分布于广东、广西、湖南等地，具有祛风止痛、舒筋活络、消肿散毒、清热利尿的功效，主要用于治疗风湿骨痛、三叉神经痛、坐骨神经痛、胃痛、手术后疼痛、跌打损伤、水肿、急性肾炎、尿血、乳腺增生等症，属于瑶医理论中的“风打相兼”药[2]。研究[3]证实，五指那藤含白桦脂酸、木通种酸等多种活性成分，能够有效抑制HIV蛋白酶[4]，但在药材鉴别研究方面未见报道。为进一步研究五指那藤植物，实验收集11批次广西、湖南、湖北、福建4的白九牛药材，对其进行生药学研究，以期为白九牛药用资源的开发利用，建立质量标准提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 RM2145半自动轮转切片机(德国徕卡仪器公司)；DM2500光学生物显微镜(德国徕卡仪器公司)；DFC500图像分析系统(德国徕卡仪器公司)；ZF-20C暗箱三用紫外分析仪(上海精密仪器仪表有限公司)。

1.2 材料 薄层色谱硅胶G板(批号：20200428，青岛海洋化工有限公司)。白九牛药材采自广西贺州市步头镇甘洞，经广西中医药大学壮医药学院韦松基教授鉴定为木通科野木瓜属植物五指那藤StauntoniaSubsp.intermedia(Y.C.Wu) T.Chen的藤茎，标本存于广西中医药大学壮瑶药重点实验室。其余产地药材见表1。

表1 白九牛样品信息

2 方法与结果

2.1 性状鉴别 本品呈长圆柱形，直径3 ～ 5 cm；表面灰黄色至灰褐色，粗糙，具不规则纵沟纹；皮部易剥离，质地坚韧，不易折断；横切面具放射状纹理和密集小孔，皮部棕褐色，木部灰黄色；髓部呈黄白色，圆形；气微，味略苦。主要鉴别点为表面具有不规则纵沟纹；横切面具放射状纹理和密集小孔；髓部黄白色，圆形。原植物如图1所示，药材如图2所示。

2.2 显微鉴别

2.2.1 茎横切面切片特征 木栓层为多列类长方形细胞，细胞排列紧密而整齐，含多数散在石细胞；靠近皮层处石细胞群列成环状，皮层窄小，细胞排列疏松；韧皮部较宽，形成层不明显，木质部宽广；射线宽广，有石细胞散在；髓部细胞类圆形，可以观察到薄壁组织中含有淀粉粒和草酸钙方晶。如图3所示。

图1 白九牛药材原植物图

图2 白九牛药材图

注：1.木栓层；2.石细胞群；3.皮层；4.韧皮部；5.木质部；6.射线；7.髓部图3 白九牛横切面的显微图

2.2.2 粉末特征 粉末为浅黄色。具缘纹孔导管碎片较多，偶见螺纹导管；石细胞较多，呈类圆形、方形、类长方形，壁厚，散在或成群分布；木纤维呈长梭形，晶鞘纤维易察见；草酸钙方晶易察见。如图4所示。

1.石细胞群；2.石细胞；3.纤维；4.草酸钙方晶；5.淀粉粒；6.导管图4 白九牛的显微粉末图

2.3 薄层色谱鉴别

2.3.1 供试品溶液的制备 采用单因素试验法，以白九牛对照药材为对照，对石油醚、乙酸乙酯、乙醇、水四种不同提取溶剂，对水浴回流30 min、超声30 min及冷浸12 h三种不同提取方式进行比较。结果表明用乙酸乙酯作为溶剂、采用回流法提取供试品溶液展开效果为佳。

2.3.2 薄层色谱条件 优选分别对薄层硅胶G板、薄层硅胶H板、薄层硅胶HF254三种不同吸附剂进行展开效果的比较试验，结果以薄层硅胶G板为吸附剂展开效果较好；分别以石油醚-乙酸乙酯-甲酸(9∶3∶0.2)、石油醚-乙酸乙酯-甲酸(9∶5∶0.2)、石油醚-乙酸乙酯-甲酸(10∶2∶0.2)为不同展开系统，进行展开效果的比较，结果将石油醚-乙酸乙酯-甲酸(9∶3∶0.2)作为展开剂时，展开效果较好，Rf值适中；分别以10%磷钼酸乙醇溶液、10%硫酸乙醇溶液、10%硫酸香草醛等三种不同显色剂显色，对显色结果进行比较，结果以10%磷钼酸乙醇为显色剂显色效果更好。

2.3.4 白九牛的薄层色谱鉴别 按供试品溶液的制备及薄层色谱条件优化结果，取白九牛粉末1 g，加入乙酸乙酯20 mL，以水浴回流法提取30 min后过滤，滤液蒸干，并定容至1 mL容量瓶中，作为供试品溶液。另取白九牛对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。按薄层色谱法试验，在同一硅胶G薄层板上，取供试品溶液和对照药材溶液点样量各10 μL，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸(9∶3∶0.2)展开，取出，晾干，在紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，出现相同颜色的斑点。如图5所示。

注：1、12为白九牛对照药材；2-11白九牛药材样品图5 白九牛TLC图

2.4 水分测定 照《中国药典》2020版“水分测定法(烘干法)”进行测定，测定11批白九牛样品的水分含量为6.7%～10.4%，结果见表2。考虑到不同产地和不同季节样品对药材质量的影响因素，故建议控制本品水分不得过12.4%。

表2 水分、总灰分、浸出物测定结果

2.5 总灰分测定 照《中国药典》2020版“灰分测定法”项下总灰分测定法进行测定，测定样品总灰分在2.8% ～ 5.4%。结果见表2。故建议本品总灰分不得过6.5%。

2.6 浸出物测定 照《中国药典》2020版“浸出物测定法”项下的热浸法进行测定，实验通过考察水和乙醇两种不同提取溶剂，考察冷浸和热浸两种不同提取方法，浸出率以30%乙醇热浸得率最高，故选择30%乙醇作为溶剂。测定样品浸出物含量为8.9%～14.9%。结果见表2。故建议本品浸出物不得低于7.1%。

3 讨论

课题组在查阅文献中发现，白九牛基原主要涉及到木通科野木瓜属4种植物：五指那藤[5-7]、尾叶那藤[8-10]、牛藤[11]和瑶山野木瓜[9]，基原种类繁多。在深入瑶族聚居地区如金秀瑶族自治县、恭城瑶族自治县等采集白九牛药材和调研过程中发现，当地白九牛的药用品种主要是两种：五指那藤和尾叶那藤。《广西壮族自治区瑶药材质量标准》[12]已将尾叶那藤作为白九牛基原品种收录其中。基于对中药资源的充分利用考虑，实验对五指那藤开展生药学研究，为扩大白九牛药用资源提供科学依据。另外，五指那藤作为药材“野木瓜藤”和同属植物短药野木瓜、钝药野木瓜被收载入《贵州省中药材、民族药材质量标准》[13]中，但是标准仅收录了野木瓜藤的性状鉴别，因此开展五指那藤的生药学鉴别研究仍具有一定的科学意义。

实验建立了白九牛的生药学鉴别方法，从结果中可知，其显微鉴别特征明显，切面射线呈放射状排列；粉末中石细胞常数个成群，具缘纹孔导管较多。

研究根据文献筛选不同的对照品如白桦脂酸、木通苯乙醇苷B等，拟作为白九牛薄层色谱鉴别的对照物质，但经过试验，未取得良好效果，推测原因是白桦脂酸、木通苯乙醇苷B与乙酸乙酯的极性差异较大，以乙酸乙酯提取出的薄层色谱鉴别供试液不含此类成分或含量较低，故本研究仅确定以白九牛对照药材作为薄层色谱鉴别的参照物。实验中对建立的白九牛薄层色谱鉴别方法的耐用性进行了考察，对不同展开温度(25 ℃和40 ℃)、不同展开湿度(26%和56%)以及不同点样方式(点状和条带点样)等进行薄层层析行为的考察，结果均表明本研究建立的薄层色谱方法对上述不同展开温度、不同湿度和不同点样方式均显示较好的薄层层析效果，说明该法耐用性良好。研究中考察了不同显色剂，出于对经济和环保的考虑，因此选择直接在紫外光(365 nm)下观察。

综上，实验确定了白九牛的主要鉴别特征，其性状和显微特征明显，对药材的鉴定工作具有实际的指导意义。研究还建立了白九牛的薄层鉴别方法，该法重复性好、耐用性佳，简便易行。测定采集的11批白九牛的水分、总灰分、浸出物的测定结果，可参考这些项目的检查结果，拟定相关检查项的限度。在对白九牛生药学鉴别研究的基础上，下一步可对其药效学、药理学及临床应用方面进行研究，为合理开发利用白九牛提供参考依据。