真武汤治疗肝癌腹水的网络药理学研究

刘秋月，洪晓华，满婷婷，荣震

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530000；2.宝安纯中医治疗医院，广东 深圳 518101）

0 引言

原发性肝癌(Primary liver cancer,PLC)，简称肝癌，源于肝细胞、肝内胆管上皮细胞的恶性疾病。2020全球癌症统计报告[1]指出，肝癌已超越胃癌，位列世界癌症死亡的第三。肝癌发病具有隐匿性，绝大部分肝癌患者确诊时已属中或晚期。其中晚期肝癌患者最常见的失代偿事件是腹水，腹水的发生与肝癌患者的低生活质量和高死亡率具有相关性[2]。当前，现代医学对肝癌腹水的规范化治疗以利尿、引流、保肝和抗肿瘤为主，但疗效欠佳且缺乏个体化治疗[3]。多项研究证实中医药联合西医治疗肝癌腹水在改善患者腰围、症状和提高生活质量、免疫功能以及延长生存时间等方面优势显著[4-7]。因此，研究具有多靶点、多通路为特点的中药处方，可让更多的肝癌腹水患者临床获益，改善情况。肝癌腹水根据其临床症状，可归“鼓胀”“蜘蛛蛊”一属。中医认为肝病日久，木克脾土致脾失健运，加之病延及肾，肝肾阴虚，阳不化水，水聚于腹中是其病机[8]。故治当以回阳保阴，健脾制水之剂。由国家中医药管理局评为第一批古代经典名方的真武汤出自汉代仲景·《伤寒论》，可用以辨治少阴阳虚、水气泛溢者，全方由附子、茯苓、芍药、白术、生姜五药组成，共奏温阳、固土、制水之功。真武汤的功效正切肝癌腹水的病机，于临床应用治疗肝癌腹水疗效较好[10,11]。但目前对于真武汤治疗肝癌腹水的作用机制尚不明确，为阐明该方治疗肝癌腹水的作用机制，借助可从多角度展现中药处方治疗疾病作用机制的网络药理学，探析真武汤治疗肝癌腹水的作用机制，以期为肝癌腹水的临床治疗与实验研究提供科学思路和依据。

1 方法

1.1 真武汤中药物成分及靶点收集

基于TCMSP（https://tcmsp-e.com/）数据库，根据OB≥30%，DL≥0.18为条件，筛选得到真武汤中5味药物的有效化学成分，同时利用DrugBank（http://www.drugbank.ca/）数据库确认经TCMSP数据库筛选得出的真武汤有效化学成分所对应的有效作用靶点。而后于Uniprot（http://www.uniprot.org/）数据库中录入经剔除相同靶点后所得的化学成分-靶点，以“Homo sapiens”条件进一步剔除非人源及重复的靶点，校正得到真武汤有效化学成分的基因靶点（Gene symbol）。

1.2 肝癌腹水靶点的获取及PPI构建

利用GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库以“Cancer of the liver ascites”为关键词，搜集肝癌腹水相关的疾病靶点，将真武汤靶点与肝癌腹水靶点使用Venny在线分析软件构建韦恩图，从而获取药物与疾病的交集靶点，通过STRING平台分析PPI网络相关信息，借助Cytoscape软件（3.7.2版）构建PPI网络，并通过Cytoscape 软件（3.7.2版）构建真武汤与肝癌腹水的“药物-成分-靶点-疾病”网络。

1.3 GO功能与KEGG通路的富集分析

通过DAVID（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）数据库对真武汤作用于肝癌腹水的靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，通过获得的生物学信息分析真武汤治疗肝癌腹水可能的作用机制，并将GO功能和KEGG通路的富集结果以可视化形式呈现。

2 结果

2.1 真武汤有效化学成分

使用TCMSP数据库挖掘，根据条件筛选后得到真武汤有效化学成分共83个，其中附子21个，茯苓15个，芍药35个，白术7个，生姜5个，真武汤部分有效化学成分见表1。

表1 真武汤部分有效化学成分表

2.2 真武汤对肝癌腹水的作用靶点

于TCMSP数据库中根据条件筛选并去重后所获得的真武汤83个有效化学成分，通过Uniprot数据库确定其对应的93个靶点，同时肝癌腹水的649个靶点由GeneCards数据库获得，而后使用Venny在线分析软件绘制韦恩图（见图1），获得真武汤与肝癌腹水的交集靶点26个，包含有IL6、VEGFA、TP53、PTGS2和MMP9等，即真武汤治疗肝癌腹水相关作用机制的26个作用靶点。

图1 真武汤与肝癌腹水的韦恩图

2.3 真武汤与肝癌腹水的PPI网络及“药物-成分-靶点-疾病”网络构建

将26个真武汤与肝癌交集靶点导入至STRING数据库平台，经分析得到PPI网络的节点数为26个，边数有134条，平均节点度是10.3，将所得结果导出，借助Cytoscape软件（3.7.2版）构建PPI网络（图2），同时筛选度值≥2倍平均节点度的关键靶点，最终获得两个关键靶点，分别是IL6和VEGFA；并通过Cytoscape 软件（3.7.2版）构建真武汤与肝癌腹水的“药物-成分-靶点-疾病”网络（图3）。

图2 真武汤与肝癌腹水的PPI网络图

图3 真武汤与肝癌腹水的“药物-成分-靶点-疾病”网络图

2.4 GO功能富集分析

使用D AVID数据库对真武汤治疗肝癌腹水的26个作用靶点进行GO功能富集分析，得到生物学过程（Biological process,BP）130条，细胞组分（Cellular component,CC）17条，分子功能（Molecular function,MF）36条，其中BP、CC和MF的PValue值前10的见图4。

图4 真武汤治疗肝癌腹水作用靶点的GO功能分析

2.5 KEGG通路富集分析

将真武汤治疗肝癌腹水的26个作用靶点输入DAVID数据库进行KEGG通路富集分析，获得30条通路，依据PValue值小于0.05为截止值，筛选得到23条通路（表2），并行可视化分析，绘制气泡图（图5），气泡形状展现的越大，表示富集基因个数越多；气泡颜色展现的越绿，表示PValue值越小，显著性越高。图中主要涉及的信号通路有NF-kappa B信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路等。

图5 真武汤治疗肝癌腹水作用靶点的KEGG通路分析

3 讨论

3.1 真武汤治疗肝癌腹水研究基础

肝癌腹水于晚期肝癌患者中常见[12]，“见肝病，知传脾”[13]，水运失司，则水湿停滞；患者病久延及少阴（肾），气化不行，则水气泛滥。真武汤之名“真武”，主镇少阴水气，功在以土制水，可温肾阳、固脾土、治水邪，阳化土固，水邪自消。药物虽只五味，但契合肝癌腹水的中医病机，效力甚佳。多名研究者发现真武汤能够有效治疗肝癌腹水。鲍文菁[4]研究发现真武汤能够较快的改善肝癌腹水情况，患者生存质量较前质优。牛红星[10]使用真武汤治疗肝癌患者30天后，观察发现患者腹水消退时间缩短，同时具有维持机体电解质平衡的作用。

3.2 真武汤成分分析

网络药理学研究得出真武汤具有多种化学成分，其治疗肝癌腹水的关键成分（OB＞80%）有Paeoniflorigenone（芍药苷）、I gnavine（惰碱）和(R)-Norcoclaurine（(R)-去甲乌药碱）。Huang Y等[14]研究表明芍药苷为单帖类物，具有细胞毒性，芍药苷可诱导肿瘤选择性凋亡，其主要提高了caspase-3对肿瘤细胞的活性；但研究亦发现芍药苷虽可诱导肿瘤凋亡，但并未诱导正常细胞凋亡，对正常细胞具有低细胞毒性。Lu JT等[15]研究显示芍药苷能减少肝癌细胞的侵袭、黏附和转移，Liu H团队[16]的研究结果与Lu JT等[15]研究一致，且发现芍药苷可抑制肝癌细胞Skp2的表达，其抑制肝癌HepG2细胞的迁移和侵袭是通过抑制细胞活力。惰碱[17]为一种低毒生物碱，具有一定的利尿作用。去甲乌药碱在该方中显现出高活性，宋莉等[18]研究表明去甲乌药碱诱肿瘤凋亡，抑制其生长。以上研究表明真武汤能通过多成分治疗肝癌腹水。

3.3 主要作用靶点分析

经分析真武汤治疗肝癌腹水的作用靶点，可得出26个作用靶点，包含有IL-6、VEGFA、TP53、PTGS2和MMP9等，其中IL-6和VEGFA为关键靶点。IL-6是一种多效细胞因子，高表达于肝癌组织中，具有增强肿瘤细胞活性的作用，同时其可通过聚集抗免疫抑制细胞起到强免疫抑制的作用[19,20]。此外，IL-6为抗肿瘤凋亡诱导剂，十分契合肝癌各阶段（起始-促动-进展）伴有细胞凋亡的特性，其可为肝癌的发生发展助力。研究表明[21,22]阻断IL-6能实现抑制肝癌细胞生长转移和促肝癌凋亡的作用。VEGFA（血管内皮生长因子A）在各癌症中普遍存在，为肿瘤新生血管的重要调控因子，还与肿瘤进展密切相关，如增殖、侵袭等[23]。岳伦莉[24]发现肝癌中VEGFA的高表达，具有逆转miR-195-5p的作用，激活肝癌细胞的发展。

3.4 主要通路分析

KEGG通路分析显示真武汤治疗肝癌腹水的26个作用靶点主要参与NF-kappa B信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路等信号通路。肝癌的发生与乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）慢性感染相关，可由其诱导产生和发展。汪静雯[25]研究发现NF-kappa B信号通路可被HBV通过miR-192-3p来激活，增加其病毒复制，可能与肝癌的发生有关。NF-kappa B受相关刺激后会影响肝癌细胞，使其激活IKK并磷酸化IKB，进而将下游靶分子激活，引起炎性反应及肿瘤新生血管的产生与侵袭。该通路所调控的既包含有强促血管因子VEGF，亦有促侵袭转移因子MMP9。朱倩等[26]研究证实NF-kappa B信号通路由活化后，肝癌细胞中的VEGF及MMP9表达会提高，肝癌细胞的侵袭能力增强，使用NF-kappa B抑制剂（BAY11-7082）后可抑制其侵袭力。HIF1α在肝癌缺氧状况下高表达，对肝癌细胞多方面有促进作用（如增殖、迁移、血管新生等）。程伟[27]研究证实天冬化合物（天冬多糖）可通过HIF1α/VEGF信号通路抑制肝癌细胞的发展和肿瘤血管的新生。

3.5 小结与展望

本研究通过网络药理学研究真武汤治疗肝癌腹水的潜在作用机制，从研究结果发现真武汤治疗肝癌腹水是通过Paeoniflorigenone（芍药苷）、Ignavine（惰碱）和(R)-Norcoclaurine（(R)-去甲乌药碱）等多种成分作用于IL-6、VEGFA、TP53、PTGS2和MMP9等多个基因靶点，从而通过NF-kappa B信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路等多通路发挥功效，通过抑制肝癌的发展而减少腹水的生成。本研究为真武汤治疗肝癌腹水的后续基础研究提供了一定的理论基础，但因网络药理学仅通过网络数据库及软件的分析预测，未能综合考虑中药各化学成分析出是否进一步相互结合产生新化合物及各药物是否会因药量变化而改变，故本研究的结果仍需进一步的验证。