参连复脉颗粒对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞极化的影响

蔡 芸，信琪琪，刘 静，高 群，缪 宇，袁 蓉，马 征，潘 熠，范 姣，丛伟红，林 谦

心房颤动(atrial fibrillation，AF)是临床最常见心律失常之一[1]。研究表明，单核细胞来源的巨噬细胞是心房颤动病人心房中最丰富的炎性细胞[2]。巨噬细胞具有不同亚型，M1型巨噬细胞是一种促炎性细胞，活化后可高表达肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)等细胞因子[3]，促进炎症发生发展，而M2型巨噬细胞则具有强大的吞噬能力，抑制炎症反应，促进组织修复免疫调节[4-5]。其中，具有促炎作用的M1型巨噬细胞增多并极化在心房电重构中起主要作用[6]。巨噬细胞在心房颤动病人的心内膜大量浸润，可以促进心肌成纤维细胞的增殖导致纤维化，参与心房颤动的发病过程[7-8]，促进巨噬细胞极化表型转化，抑制炎症反应，可能在心房颤动治疗中发挥重要作用。

参连复脉颗粒(原益气复脉合剂)是传承名老中医学术思想拟定而成，前期临床研究证实合并窦房结病变的心房颤动病人射频消融术后应用参连复脉颗粒，能减少心房颤动复发，改善窦房结功能，改善临床症状[9]。本实验通过建立脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应模型，探讨参连复脉颗粒含药血清对RAW264.7巨噬细胞极化的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞及药品 小鼠RAW264.7单核巨噬细胞株，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；阿托伐他汀钙(atorvastatin calcium)：CAS号344423-98-9，分子量1 209.39(Sigma公司)；LPS：CAS号93572-42-0(Sigma公司)；参连复脉颗粒(北京中医药大学东方医院院内制剂，专利号2013 1 0303390.5)，组方：党参5 g，丹参5 g，黄连3 g，法半夏2.5 g，赤芍3 g，川芎3 g，鬼箭羽3 g，白芍3 g，远志3 g，酸枣仁5 g，炙甘草5 g，由北京中医药大学中药学院经水提、醇提、干燥及颗粒成型工艺加工后制成18 g浸膏粉颗粒。

1.2 主要试剂与仪器 杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM，Gibco公司)；破膜工作液(Servicebio公司)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，Servicebio公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂盒(北京Solarbio公司)；CD68抗体(Abcam 公司，ab53444)；CD163抗体(Abcam 公司，ab182422)；TNF-α抗体(Abcam 公司，ab66579)；IL-6抗体(Abcam 公司，ab7737)；酶标仪(美国BioTek公司)；荧光倒置显微镜(德国LEICADMIL LED)；离心机(美国BECKMAN COULTER Allgra X-15R)；转移脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造公司)；电泳仪(北京六一仪器厂)；垂直电泳槽(北京六一仪器厂)；转移槽(北京六一仪器厂)。

1.3 实验方法

1.3.1 含药血清制备、细胞造模、分组与给药 健康雄性SD大鼠24只，随机分为空白组、中药组。中药组给予参连复脉颗粒0.81 g/(kg·d)，连续灌胃3 d，末次给药2 h后腹主动脉取血，室温静置0.5 h，3 000 r/min离心15 min，分离血清，于56 ℃水浴锅灭活30 min，0.22 μm滤膜过滤除菌，于-80 ℃保存备用。炎症细胞模型构建及分组：使用LPS 0.1 μg/mL刺激RAW264.7细胞24 h构建巨噬细胞炎症模型。将细胞分为正常对照组(RAW264.7+空白血清)、模型组(RAW264.7+LPS+空白血清)、中药组(RAW264.7+LPS+参连复脉颗粒含药血清)、阿托伐他汀钙组(RAW264.7+LPS+空白血清+10 μmol/L阿托伐他汀钙)。

1.3.2 MTT法 将RAW264.7细胞悬液以6×103个/孔接种于96孔板中，每孔100 μL，在细胞培养箱中培养过夜至细胞贴壁。第2天，按照实验分组加入100 μL一定浓度药物干预细胞24 h，吸取上清液弃去后，每孔加入MTT液10 μL和完全培养基90 μL，37 ℃、含5%CO2培养箱中继续孵育4 h后，在酶联免疫检测仪490 mm处测量各孔吸光度值，根据吸光度值(OD)比较细胞活力。所有结果均来自至少3个独立实验。

1.3.3 荧光染色双标法 收集对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞悬液浓度，按照8×104个/mL密度将细胞接种到6孔板中，每孔2 mL，6孔板底放入细胞爬片，贴壁后，按照不同分组加入一定浓度药物处理24 h后，加入2 mL 4%多聚甲醛室温固定30 min；100 μL破膜工作液细胞破膜20 min；3% BSA封闭30 min；滴加一抗大鼠抗小鼠CD68抗体和兔抗小鼠CD163抗体，湿盒内4 ℃孵育过夜；滴加二抗CY3标记的羊抗大鼠和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)，室温孵育50 min；二脒基苯基吲哚(DAPI)复染细胞核；抗荧光淬灭封片剂封片；镜检拍照；结果判读：CD68+呈红色荧光，CD163+呈绿色荧光，用Image J 进行细胞计数用于计算CD163+/CD68+RAW264.7细胞所占比例以反映RAW264.7细胞极化情况。

1.3.4 蛋白质免疫印迹法(Western Blot) 提取各组RAW264.7细胞蛋白，根据蛋白定量结果，加入相应体积的总蛋白样品与5×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液，轻轻混合，95 ℃变性10 min，将30 μg样品轻轻加至凝胶孔中，将电压调至80 V 使样品通过浓缩胶与分离胶(电压约8 V/cm)，电泳使染料至分离胶适当位置，结束电泳；采用半干转的转膜方式，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，转膜条件：电流100 mA，电压60 V左右，转膜时间为60 min。取出转移膜置于封闭液中，室温摇床上封闭1 h，放入稀释后的TNF-α、IL-6(1∶1 000)一抗工作液中，4 ℃孵育过夜；用洗膜缓冲液TBST洗膜10 min×3次，加入稀释后的二抗工作液(1∶2 000)中，室温避光1 h，TBST洗膜10 min×3次，曝光及洗片，利用UVP凝胶成像分析系统采图，分析软件分析灰度值。

1.4 统计学处理 采用SPSS 26.0及GraphPad Prism 9.0软件进行数据分析。符合正态分布的定量资料组间比较采用单因素方差分析，不符合正态分布或方差不齐者的定量资料组间比较采用非参数检验。以P<0.05为差异有统计意义。

2 结 果

2.1 4组LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞活力比较 与正常对照组比较，模型组细胞活力OD值升高(P<0.05)，提示LPS可促进RAW264.7巨噬细胞增殖；与模型组比较，中药组和阿托伐他汀钙组细胞活力OD值降低(P<0.05)；中药组与阿托伐他汀钙组细胞活力OD值比较差异无统计学意义(P>0.05)。表明参连复脉颗粒含药血清可以抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞增殖，且效果与阿托伐他汀相当。详见图1。

与正常对照组比较，＊ P<0.05；与模型组比较，# P<0.05。

2.2 4组CD163+/CD68+比值比较 与正常对照组比较，模型组CD163+/CD68+比值降低(P<0.05)；与模型组比较，中药组和阿托伐他汀钙组CD163+/CD68+比值升高(P<0.05)；阿托伐他汀钙组与中药组CD163+/CD68+比值比较差异无统计学意义(P>0.05)。说明LPS诱导的巨噬细胞以M1型极化为主，参连复脉颗粒含药血清可以降低M1型巨噬细胞极化的比例，促进巨噬细胞向M2型极化，且与阿托伐他汀钙效果相当。详见图2、图3。

与正常对照组比较，＊ P<0.05；与模型组比较，# P<0.05。

图3 免疫荧光检测4组LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞由M1向M2表型转化情况(×400)

2.3 4组IL-6、TNF-α蛋白表达水平比较 与正常对照组比较，模型组IL-6、TNF-α蛋白表达水平升高(P<0.05)；与模型组比较，中药组IL-6、TNF-α蛋白表达水平降低(P<0.05)，阿托伐他汀钙组IL-6、TNF-α蛋白表达水平呈下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，提示参连复脉颗粒含药血清可以一定程度抑制LPS诱导的巨噬细胞炎性因子IL-6、TNF-α的表达，可抑制炎症反应，促进巨噬细胞由M1型向M2型极化。详见图4～图6。

与正常对照组比较，＊ P<0.05；与模型组比较，# P<0.05。

与正常对照组比较，＊ P<0.05；与模型组比较，# P<0.05。

图6 4组IL-6、TNF-α蛋白表达条带图

3 讨 论

炎症是诱发和导致持续心房颤动的危险因素[10]，炎性因子水平的高低与心房颤动的发生和维持等密切相关。研究表明，心房颤动病人C反应蛋白(CRP)、IL-6和TNF-α水平明显升高[11]，且血浆中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α因子水平明显高于正常组，这些因子水平与心房颤动独立相关[12]。另外，炎性因子水平与心房颤动病人进行心脏复律的预后以及复发预测也密切相关[13]。抗炎药物对心房颤动的影响也证明了心房颤动与炎症之间的关系，他汀类药物可以明显降低心房颤动的复发率[14]，降低CRP、IL-6和TNF-α的水平，如阿托伐他汀钙可能通过抑制山羊心包炎模型炎症来延长心房有效不应期及缩短心房颤动持续时间[15]。

巨噬细胞是一种异质性的免疫细胞，通过合成和分泌多种炎症介质，包括IL-6、TNF-α等，在对抗病原体的第一线防御中扮演主要角色，并调节和平衡病原体或组织引起的炎症过程[16-17]。可塑性是巨噬细胞的关键特征，循环的单核细胞可以离开血液并迁移到组织中，在炎症期间更容易分化为巨噬细胞；同时，微环境中局部生长因子、促炎细胞因子等会诱导巨噬细胞激活并极化为不同的表型，表现出功能性变化，在炎症性疾病的进展中发挥重要作用[18-19]。根据表面标记物的表达、特定因子的产生和生物活性，单核细胞来源的巨噬细胞可以分为促炎作用的经典活化巨噬细胞(M1)和有抑炎作用的替代激活巨噬细胞(M2)两种类型[20-21]。M1型巨噬细胞通常是由TH1细胞因子诱导的，如TNF-α、γ干扰素(IFN-γ)或LPS，这些巨噬细胞活化后可产生和分泌高水平的促炎细胞因子，如TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6和iNOS等，这些因子参与机体的防御机制，有助于吞噬外来病原体，M1型巨噬细胞还可直接分化为TH1和TH17抗炎细胞，并进行扩增，加剧炎症反应，若该应答得不到控制，则可导致组织损伤，损害组织再生和伤口愈合，加重病情发展[21-24]。M2型巨噬细胞具有强大的吞噬能力，为了防止组织损伤，M2型巨噬细胞的清除凋亡细胞、抑制炎症反应、促进组织修复免疫调节等特性抑制了慢性炎症反应的进程[5-6，25]。在正常组织中，M1与M2型巨噬细胞的比值是受高度调控的，通过各自的细胞因子发挥作用。在炎症反应中，这一比例发生了改变，向M1型方向极化为主。在表型上，M1经典激活的巨噬细胞比M2替代激活的巨噬细胞更小，空泡化程度低[26-27]。由于基因或微环境的干扰，炎症调节的丧失可能会诱发许多疾病。心房颤动长期以来都被认为与炎症有关[28]，故将巨噬细胞的极化从促炎状态恢复到抗炎状态对炎症性疾病的治疗可能有重要意义。

心房颤动属于中医学“心悸”“怔忡”范畴，其基本病机有虚、实两方面，虚者为气血阴阳亏损，心神失养所致；实者则多由痰热、水饮、瘀血等实邪扰乱心神所致，虚实之间又多相互夹杂转化。参连复脉颗粒是基于中医经典气血理论和名老中医经验开发而成的院内制剂，临床应用多年。方中党参补脾益气，丹参活血安神，合用针对气虚血瘀的主要病机，共为君药；黄连清心降火，法半夏燥湿化痰，二药合用有清热化痰之效，共为臣药；赤芍凉血化瘀，川芎行气活血，鬼箭羽活血通经，白芍养血柔肝，远志安神定志，酸枣仁养心安神，六药合用为佐药，佐助君药增强行气活血、安神止悸之功；炙甘草益气复脉、调和药性，故为佐使药。全方充分体现了气帅血行、标本兼治的组方特点，以达到益气活血、清心化痰、安神复脉的功效。

本课题组前期临床研究显示，参连复脉颗粒可降低气虚血瘀、痰瘀互阻型病人24 h动态心电图室性期前收缩次数，改善心悸症状，安全性好，未发现明显不良反应[9]。前期实验研究表明，参连复脉颗粒可以降低高血压大鼠模型升高的血清炎性因子TNF-α、IL-6水平，对部分心房电特性异常有抑制作用，可能有抑制心房颤动易感性增加的作用[29]。为研究参连复脉颗粒含药血清是否可能抑制巨噬细胞炎症反应，诱导巨噬细胞表型极化，本研究建立LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应模型，MTT法检测结果提示参连复脉颗粒含药血清可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞增殖，且效果与阿托伐他汀钙相当。Western Blot法检测参连复脉颗粒含药血清对LPS诱导的RAW264.7细胞IL-6、TNF-α蛋白表达的影响，结果提示LPS刺激巨噬细胞分泌IL-6、TNF-α因子，参连复脉颗粒含药血清可以抑制LPS诱导的巨噬细胞IL-6、TNF-α蛋白的分泌表达，抑制LPS诱导的炎症反应，促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化。

CD68是巨噬细胞表面的特异性分子标志物[30]，M2型巨噬细胞具有强大的吞噬能力，可以抑制炎症反应[6]，其常见的表面标志有清道夫受体(CD163)和甘露糖受体(CD206)等[31]。通过免疫荧光双标法检测巨噬细胞极化，发现巨噬细胞经LPS诱导后，模型组CD163+/CD68+比值较正常对照组降低，中药组较模型组升高，说明LPS诱导的巨噬细胞以M1型极化为主，参连复脉颗粒含药血清可以降低M1型巨噬细胞极化的比例，促进巨噬细胞向M2型极化，且效果与阿托伐他汀钙相当。

综上所述，参连复脉颗粒含药血清可以抑制活化巨噬细胞中炎症介质的释放，一定程度上抑制了RAW264.7巨噬细胞向M1型极化，促进其向M2型极化，这可能是其治疗心房颤动的一个可能机制。本研究结果为参连复脉颗粒对心房颤动的早期预防和治疗提供依据，但其产生这些效应的更多机制还需进一步探究。