miR-199b-5p调控HAPLN1对宫颈癌细胞顺铂耐药性的影响

韩朝辉 龙静 刘洁玲 陈学 王静

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，在全球女性常见恶性肿瘤中发病率排名第四，大多数患者进行治疗时，已进入疾病中晚期，因而治愈困难，易复发，对女性的生命健康造成严重威胁[1,2]。化疗是宫颈癌的主要临床治疗手段，顺铂(cisplatin，DDP)作为化疗一线药物，广泛应用于宫颈癌，特别是晚期宫颈癌的治疗，但长期应用顺铂易使肿瘤细胞产生耐药性，严重影响疗效，导致治疗失败[3,4]。miR-199b-5p是一种肿瘤抑制因子，可介导调控癌细胞的增殖、凋亡、侵袭迁移和化疗耐药过程，上调其表达，可减轻大肠癌的远处迁移，抑制三阴乳腺癌的裸鼠异种移植瘤生长，降低其增殖和侵袭迁移能力，并减弱其顺铂耐药性[5,6]；另外有研究发现，miR-199b-5p在宫颈癌组织中表达水平比较正常宫颈组织明显降低，促进其表达，可降低人乳头瘤病毒引发宫颈癌的危险性[7]，因而推测miR-199b-5p可能参与调控宫颈癌细胞的顺铂耐药过程。透明质酸蛋白聚糖连结蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1，HAPLN1)可调控肿瘤的耐药性，是多发性骨髓瘤的一种致病因子，上调其表达，可促使多发性骨髓瘤细胞对硼替佐米产生耐药性；敲低HAPLN1的表达，可增强人大肠癌耐药细胞株对甲氨蝶呤的敏感性，增强甲氨蝶呤导致的大肠癌细胞凋亡[8,9]，HAPLN1在肾透明细胞癌中高表达，且受miR-199a-5p调控，并与患者的总体生存率显著负相关[10]，但miR-199b-5p对宫颈癌细胞顺铂耐药性和HAPLN1表达的调控作用，目前还未有研究，本文通过构建人宫颈癌顺铂耐药细胞株HeLa/DDP，对此进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与试剂：人宫颈癌细胞HeLa、MEM培养基、青链霉素溶液购买于武汉普诺赛生命科技有限公司，货号CL-0101、PM150410、PB180120；顺铂(纯度≥98%)购买于上海信裕生物科技有限公司，货号XY24462；胎牛血清、Opti-MEM培养基购买于美国Gibco公司，货号10099-141、31985-070；LipofectamineTM2000、CCK-8试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒、总RNA提取试剂盒、一步法逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTMII、高效RIPA裂解液购买于北京索莱宝科技有限公司，货号11668-027、CA1210、PC0020、CA1050、R1200、T2240、SR1110、R0010；miR-199b-5p、U6、GAPDH、HAPLN1及多药耐药基因1(multidrug resistance 1，MDR1)引物、miR-199b-5p mimics阴性对照、miR-199b-5p mimics购买于上海吉玛制药技术有限公司；羊抗兔二抗、兔源β-actin一抗、兔源P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)一抗、兔源HAPLN1一抗购买于美国Abcam公司，货号ab150077、ab227387、ab170904、ab181997等。

1.1.2 主要仪器：酶标仪购买于南京德铁实验设备有限公司，型号HBS-1096C；流式细胞仪购自美国Beckman公司，型号CytoFLEX；DNA合成仪购买于中国科学院天津工业生物技术研究所，型号Dr.Oligo-192；荧光定量PCR仪购买于美国应用生物系统公司，型号7900HT；小型垂直电泳转印系统购买于美国Bio-Rad公司，型号1658033；蛋白免疫印迹成像系统购买于美国Thermo Fisher Scientific公司，型号iBright等。

1.2 方法

1.2.1 建立人宫颈癌顺铂耐药细胞株HeLa/DDP并鉴定:复苏购买的人宫颈癌细胞HeLa，经5 ml完全培养液(MEM培养基+10%胎牛血清+1%青链霉素)重悬后，接种在25 cm2培养瓶中，在37℃恒温培养箱(5%CO2、95%湿度)中培养，依次向培养液中加入浓度逐渐升高的顺铂，使HeLa细胞发生耐药[11]，顺铂浓度从低到高依次为0.5、1、2、4、8、10、12、14、16、18、20 nmol/L，每个浓度培养1 d，活细胞传代后，加入下1个更高的浓度继续培养，直到HeLa细胞无明显凋亡，稳定生长，即得到人宫颈癌顺铂耐药细胞株HeLa/DDP。以CCK-8实验鉴定HeLa/DDP细胞的顺铂耐药性：取处于对数生长期的HeLa和HeLa/DDP细胞，以胰酶消化、计数后，以1×105个/ml的密度分别接种在96孔培养板培养，24 h后以终浓度20 nmol/L的顺铂处理两种细胞，每种细胞设6个孔作为重复，并选6个孔不接种细胞，只加培养液做空白对照，以不经顺铂处理的HeLa细胞做对照，继续培养48 h后，各孔中均加入CCK-8试剂，2 h后放入酶标仪中混匀，于450 nm波长下测得各孔吸光度(optical density，OD)，计算2种细胞生存率，公式：生存率(%)=(实验组OD值-空白对照组OD值)/(对照组OD值-空白对照组OD值)×100%。

1.2.2 qRT-PCR检测HeLa及HeLa/DDP中miR-199b-5p水平：取处于对数生长期的HeLa及HeLa/DDP细胞，以胰酶消化后，使用总RNA提取试剂盒，参照说明书的指导分别提取细胞中总RNA，配制qRT-PCR反应体系预混液：取10 μl 2×SYBR Premix Ex TaqTMII、灭菌蒸馏水6 μl、ROX染料0.4 μl、上游引物0.8 μl、下游引物0.8 μl，加入反应管中，此时取适量的总RNA，采用逆转录试剂盒，参照说明书的指导制成cDNA后，再向反应管中加入cDNA模板2 μl，混匀后放入荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件参照试剂说明书的指导设定，所得数据根据算法2-ΔΔCt进行分析，选择U6作为miR-199b-5p的内参基因。

1.2.3 分组转染处理细胞并收集标本：取处于对数生长期的HeLa/DDP细胞，以胰酶消化后，接种在24孔培养板培养，24 h后随机分为对照组、miR-199b-5p mimics组、顺铂+miR-199b-5p mimics阴性对照组、顺铂+miR-199b-5p mimics组，参照说明书和文献[12]中的方法进行转染：将miR-199b-5p mimics、miR-199b-5p mimics阴性对照分别溶解在50 μl Opti-MEM无血清培养基中，同时将2 μl LipofectamineTM2000溶解在100 μl Opti-MEM无血清培养基中制成LipofectamineTM2000溶液，然后将miR-199b-5p mimics及miR-199b-5p mimics阴性对照溶液与50 μl LipofectamineTM2000溶液混匀、静置，20 min后分组加入培养孔中处理细胞，此时弃去培养液，更换为Opti-MEM无血清培养基，并向顺铂+miR-199b-5p mimics阴性对照组、顺铂+miR-199b-5p mimics组培养孔中加入终浓度20 nmol/L的顺铂处理细胞，6 h后弃去Opti-MEM无血清培养基，更换为完全培养液，同时再次加入顺铂，保持其终浓度不变，继续培养48 h后收集各组细胞，重复上述实验操作3次，收集3份细胞。

1.2.4 检测各组细胞增殖情况：取处于对数生长期的HeLa/DDP细胞，以胰酶消化、计数后，以1×105个/ml的密度接种在96孔培养板培养，24 h后参照1.2.3中步骤分组转染并处理细胞，并参照1.2.1中CCK-8实验步骤测定各组细胞生存率。

1.2.5 流式细胞实验检测各组细胞凋亡情况：取1份1.2.3中收集的各组细胞，通过PBS分别重悬，混匀后计数，根据结果取约1×106个细胞，将其细胞液放入离心机内离心，5 min后加入PBS洗涤细胞，再次离心后，弃去上清，依次加入10 μl ArmexinV-FITC、500 μl Binding Buffer、5 μl PI，小心吹打均匀后，37℃避光孵育，15 min后离心，弃去上清，再次以PBS洗涤细胞后，加入200 μl PBS溶液，小心吹打均匀后，上机检测各组细胞凋亡情况。

1.2.6 qRT-PCR检测各组细胞miR-199b-5p和HAPLN1、MDR1 mRNA水平：取1份1.2.3中收集的各组细胞，通过qRT-PCR实验按照上述1.2.2的步骤检测其中miR-199b-5p和HAPLN1、MDR1 mRNA水平，选择U6作为miR-199b-5p的内参基因，选择GAPDH作为HAPLN1和MDR1的内参基因。见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.7 免疫印迹测定各组细胞HAPLN1和P-gp的蛋白表达：取1份1.2.3中收集的各组细胞，通过高效RIPA裂解液裂解细胞并离心，以BCA蛋白浓度测定试剂盒测定上清中总蛋白浓度，具体操作参照各自说明书的指导进行，将各组样品液中蛋白浓度调至相同，以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后通过湿转将其转印到硝酸纤维素膜上，使用5%的低脂奶粉溶液37℃孵育2 h，封闭膜上蛋白的非特异性抗原，分别加入兔源β-actin一抗、兔源P-gp一抗、兔源HAPLN1一抗，4℃冰箱中孵育过夜，经TBST洗膜3次，5 min/次，加入羊抗兔二抗，37℃摇床上缓缓摇动孵育2 h，经TBST再次洗膜3次，5 min/次，以增强化学发光试剂显色后采用蛋白免疫印迹成像系统拍摄图片，最后以Image J软件分析图像并计算条带灰度值，获得各组目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 HeLa/DDP耐药性鉴定结果 与对照组比较，HeLa细胞生存率明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；HeLa/DDP细胞生存率无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.2 miR-199b-5p在HeLa与HeLa/DDP中的表达结果 与HeLa细胞比较，miR-199b-5p在HeLa/DDP细胞中表达明显降低(P<0.05)。见表3。

2.3 4组细胞生存率检测结果 与对照组比较，顺铂+miR-199b-5p mimics组细胞生存率明显降低(P<0.05)，miR-199b-5p mimics组、顺铂+miR-199b-5p mimics阴性对照组细胞生存率无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)；与miR-199b-5p mimics组比较，顺铂+miR-199b-5p mimics组细胞生存率明显降低(P<0.05)，顺铂+miR-199b-5p mimics阴性对照组细胞生存率无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)；与顺铂+miR-199b-5p mimics阴性对照组比较，顺铂+miR-199b-5p mimics组细胞生存率明显降低(P<0.05)。见表4。

表2 HeLa和HeLa/DDP细胞生存率比较

表3 Hela和Hela/DDP中miR-199b-5p水平的比较

表4 4组细胞生存率比较

2.4 4组细胞凋亡率检测结果 与对照组比较，顺铂+miR-199b-5p mimics组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，miR-199b-5p mimics组、顺铂+miR-199b-5p mimics阴性对照组细胞凋亡率无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)；与miR-199b-5p mimics组比较，顺铂+miR-199b-5p mimics组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，顺铂+miR-199b-5p mimics阴性对照组细胞凋亡率无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)；与顺铂+miR-199b-5p mimics阴性对照组比较，顺铂+miR-199b-5p mimics组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。见图1，表5。

图1 4组细胞凋亡情况的流式细胞检测结果；A 对照组；B miR-199b-5p mimics组；C 顺铂+miR-199b-5p mimics阴性对照组；D 顺铂+miR-199b-5p mimics组

表5 4组细胞凋亡率比较

2.5 4组细胞miR-199b-5p及HAPLN1、MDR1 mRNA水平检测结果 与对照组比较，顺铂+miR-199b-5p mimics组、miR-199b-5p mimics组miR-199b-5p明显升高，HAPLN1、MDR1 mRNA水平明显降低(P<0.05)，顺铂+miR-199b-5p mimics阴性对照组细胞HAPLN1、MDR1 mRNA水平无明显改变(P>0.05)；与顺铂+miR-199b-5p mimics阴性对照组比较，miR-199b-5p mimics组和顺铂+miR-199b-5p mimics组细胞miR-199b-5p明显升高，HAPLN1、MDR1 mRNA水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 4组细胞miR-199b-5p及HAPLN1、MDR1 mRNA水平比较

2.6 4组细胞HAPLN1及P-gp蛋白表达水平的检测结果 与对照组比较，顺铂+miR-199b-5p mimics组、miR-199b-5p mimics组细胞HAPLN1、P-gp蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，顺铂+miR-199b-5p mimics阴性对照组细胞HAPLN1及P-gp蛋白表达水平无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)；与顺铂+miR-199b-5p mimics阴性对照组比较，miR-199b-5p mimics组和顺铂+miR-199b-5p mimics组细胞HAPLN1及P-gp蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。见图2，表7。

图2 4组细胞HAPLN1及P-gp蛋白表达的免疫印迹检测结果;A 对照组；B miR-199b-5p mimics组；C 顺铂+miR-199b-5p mimics阴性对照组；D 顺铂+miR-199b-5p mimics组

表7 4组细胞HAPLN1及P-gp蛋白相对表达比较

3 讨论

宫颈癌作为临床中妇科常见的生殖系统恶性肿瘤，在女性中的发病率仅次于乳腺癌，是女性死于癌症的主要原因[13,14]。顺铂是杀伤实体瘤的化疗药物，广泛应用在头颈部恶性肿瘤、膀胱癌、卵巢癌和宫颈癌等多种肿瘤的临床治疗中，然而顺铂的长期使用易导致肿瘤细胞的获得性耐药，是造成宫颈癌化疗效果不佳的关键因素，因而阐明其耐药机制并找到新的作用靶点对宫颈癌的治疗意义重大[15,16]。

本文通过逐步增加人宫颈癌细胞HeLa培养液中顺铂浓度的方法构建其顺铂耐药细胞株HeLa/DDP，研究结果发现，HeLa/DDP在浓度为20 nmol/L的顺铂作用下，与未经顺铂处理的HeLa细胞比较，生存率无明显变化(100%)，无明显凋亡发生，同时细胞的增殖情况良好、稳定，表明人宫颈癌顺铂耐药细胞株HeLa/DDP构建成功。

miR-199b-5p是一种微小RNA，可调控细胞增殖、分化、凋亡及代谢等生理过程，在直肠癌、肾癌、甲状腺癌、乳腺癌等多种肿瘤的发生及病情进展中发挥关键的调控作用。研究发现，miR-199b-5p高表达预示着晚期直肠癌患者放化疗的疗效较好[17]；肾细胞癌组织中miR-199b-5p的表达水平明显低于癌旁组织，下调其表达，可促进肾癌细胞增殖和迁移，同时降低其凋亡率[18]；miR-199b-5p还参与介导肿瘤细胞的耐药过程，促进miR-199b-5p表达，能抑制甲状腺癌细胞增殖，并增强其凋亡和对化疗药物紫杉醇的敏感性，还可减弱三阴乳腺癌细胞的移植瘤生长及顺铂耐药性[7,19]。且有研究证实，miR-199b-5p参与调控宫颈癌的发生发展[8]，但其对宫颈癌细胞顺铂耐药性的影响，笔者发现，截至目前还没有清楚阐释。

本文通过qRT-PCR实验测定人宫颈癌细胞HeLa和其顺铂耐药细胞株HeLa/DDP中miR-199b-5p的表达水平，发现比较HeLa细胞，miR-199b-5p在HeLa/DDP细胞中表达明显降低，以miR-199b-5p mimics和顺铂联合处理HeLa/DDP细胞，比较对照组和miR-199b-5p mimics组，可明显降低细胞生存率，升高其凋亡率，表明miR-199b-5p mimics参与调控人宫颈癌细胞的顺铂耐药过程，上调miR-199b-5p表达，可增强顺铂对耐药细胞株HeLa/DDP的杀伤力，增强人宫颈癌细胞对顺铂的敏感性。

MDR1是一种多药耐药基因，其转移翻译的蛋白产物P-gp作为一种能量依赖性的转运蛋白，可将化合物逆向转运出细胞，是调控肿瘤细胞多药耐药过程的主要蛋白[20]。研究表明，HAPLN1作为一种透明质酸蛋白聚糖连结蛋白，可稳定透明质酸与肿瘤细胞表面受体的结合，继而促进肿瘤细胞迁移、侵袭、转移以及肿瘤血管生成，NF-κB作为一种转录因子，在包括多发性骨髓瘤在内的许多血液系统恶性肿瘤细胞的存活和增殖中起关键作用，HAPLN1可通过激活NF-κB通路，促使MM细胞对硼替佐米产生耐药性，下调HAPLN1表达水平，可抑制IKK/NF-κB p65信号活化，进而增强甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)对人大肠癌耐药细胞株HT-29/MTX的敏感性，提高其杀伤作用，提示HAPLN1在肿瘤的耐药性获得过程中发挥着关键的调控作用[9,10]，有可能是miR-199b-5p减轻人宫颈癌细胞对顺铂耐药性的作用靶点。

本文研究结果显示，以miR-199b-5p mimics处理HeLa/DDP细胞，与对照组比较，可明显降低细胞HAPLN1及MDR1 mRNA水平、HAPLN1及P-gp蛋白表达水平，并明显升高miR-199b-5p表达；以miR-199b-5p mimics和顺铂联合处理HeLa/DDP细胞，与对照组比较，不仅可明显降低细胞HAPLN1及MDR1 mRNA水平、HAPLN1及P-gp蛋白表达水平，还可明显降低细胞生存率，并升高其凋亡率和miR-199b-5p表达；以miR-199b-5p mimics和顺铂联合处理HeLa/DDP细胞，与miR-199b-5p mimics组比较，仅可明显降低细胞生存率，并明显升高其凋亡率，而不改变miR-199b-5p、HAPLN1及MDR1 mRNA水平、HAPLN1及P-gp蛋白表达水平，表明上调miR-199b-5p表达，可下调HAPLN1和耐药基因MDR1的表达，提高人宫颈癌细胞对顺铂的敏感性，减轻其耐药性，进而促进其凋亡。

综上所述，miR-199b-5p在人宫颈癌顺铂耐药细胞株HeLa/DDP中表达明显降低，促进miR-199b-5p表达，可下调HAPLN1、耐药基因MDR1和其蛋白产物P-gp的表达，增强HeLa/DDP对顺铂的化疗敏感性，抑制其增殖，并促进其凋亡，表明miR-199b-5p是缓解宫颈癌化疗耐药的作用靶点之一，调控HAPLN1表达可能是其分子机制。