乳腺肿瘤冷冻切片和石蜡切片中RAGE和Ki-67的差异表达及其意义

李江伟，李贞，夏雨涵，黄培，李振乾，秦慧，高冬玲

（郑州大学第一附属医院病理科，郑州 450052）

在临床病理诊断中，免疫组织化学越来越成为不可或缺的诊断技术。冷冻切片由于组织新鲜、抗原丢失少等优势很早便用于免疫组织化学检测。但冷冻切片也有缺点，组织形态差异大、存在冰晶等因素影响了其免疫组织化学实验的结果[1]。本实验选取两个在乳腺肿瘤组织中表达普遍的胞质蛋白晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end product，RAGE）[2]和胞核蛋白Ki-67作为研究对象，分析其在石蜡和冷冻切片中的表达情况，进一步探讨冷冻切片用于免疫组织化学检测的适用条件和价值。

材料与方法

1 材料

选取我院2021年9月到11月的乳腺肿瘤术中切除标本15例，其中乳腺浸润癌13例，导管原位癌1例，叶状肿瘤1例。分别收集这15例标本的冷冻切片和相对应的石蜡切片若干。

1.1 试剂

实验室自配乙醇-冰醋酸-甲醛（ethanol-acetic acid-formaldehyde，EAF）固定液[3]，用于冷冻切片的固定；0.01 mol/L PBS缓冲液（pH7.4）购自莱宝生物技术公司。兔抗RAGE一抗购自Bioss公司，兔抗Ki-67一抗购自Wanleibio公司，通用型羊抗兔/鼠SP试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥公司。

1.2 主要仪器

Leica 3050S冷冻切片机，K-Viewer图像扫描仪，Image-Pro plus 6.0 图像分析软件。

2 方法

2.1 标本制备

新鲜的乳腺肿瘤组织经取材后于冷冻切片机中（-24 ℃）6 μm切片，随后立即用EAF固定液固定8 min[4]；每例对应的冰余组织待固定、脱水和石蜡包埋后4 μm切片。以上切片均立即行免疫组织化学检测或-20 ℃冰箱内保存，但保存时长均不超过2周[5]。

2.2 SP法免疫组织化学染色

SP法免疫组织化学染色：①脱蜡和水化；②0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）抗原热修复；③胞膜通透剂0.3% Triton X 100孵育10 min；④3% H2O2阻断内源性过氧化物酶；⑤正常山羊血清封闭；⑥一抗37 ℃恒温孵育1 h；⑦生物素标记山羊抗兔/鼠IgG 37 ℃恒温孵育10 min；⑧HRP标记链霉卵白素37 ℃恒温孵育10 min；⑨新鲜配制的DAB显色液显色3～5 min。冷冻切片的免疫组织化学步骤略去①和②，石蜡切片的免疫组织化学步骤略去③，其余与试剂盒说明书推荐步骤相同。用已知RAGE阳性的乳腺癌切片作为阳性对照，PBS代替一抗用作为阴性对照。

3 统计分析

实验后的免疫组织化学切片用K-Viewer图像扫描仪扫描，选取阳性部位输出图片，用Image-Pro plus 6.0分析每例标本的石蜡、冷冻切片中阳性表达的RAGE和Ki-67的表达强度，即光密度值[6]，数据以均数±标准差表示。使用independent-samples t test和χ2检验分析，所有数据资料均用SPSS19.0统计软件分析，以α=0.05（2-tailed）为显著性检验水准。

结果

RAGE和Ki-67在乳腺癌石蜡切片中均呈阳性表达，分别定位在胞质和胞核（图1A、B）；二者在乳腺叶状肿瘤中也有表达，主要在上皮表达，间质细胞表达较低（图1C、D）；此外，RAGE和Ki-67在乳腺癌癌旁组织中的炎性细胞里有少量表达（图1E、F）；阴性对照切片中两种蛋白免疫组织化学染色均为阴性（图1G、H）。在冷冻切片中，RAGE和Ki-67免疫反应产物常定位不清（图1LM）；二者的阳性表达率分别为53.33%（8/15）和66.67%（10/15），明显低于在石蜡切片中的阳性表达率（100%, 15/15和100%，15/15）（P＜0.05）；此外，两种蛋白石蜡切片中的表达强度也明显要强于在冷冻切片中的表达强度（图1N；P＜0.01）。

图1 RAGE和Ki-67在乳腺肿瘤石蜡切片和冷冻切片中免疫组织化学染色比较。A和B，乳腺癌石蜡切片中RAGE和Ki-67免疫组织化学染色；C和D，乳腺叶状肿瘤石蜡切片中RAGE和Ki-67免疫组织化学染色；E和F，乳腺癌癌旁组织的炎性细胞中RAGE和Ki-67免疫组织化学染色；G和H，RAGE和Ki67在阴性对照切片中呈阴性；J和K，乳腺肿瘤冷冻切片中RAGE和Ki-67免疫组织化学染色；L和M，乳腺肿瘤冷冻切片中RAGE和Ki-67免疫组织化学染色，阳性免疫反应产物定位模糊；N，乳腺肿瘤冷冻切片和石蜡切片中RAGE和Ki-67免疫反应性比较；比例尺，100 μm； **P＜0.01，n=15 Fig. 1 Comparison of immunohistochemical staining of RAGE and Ki-67 in paraffin sections and frozen sections of breast tumors. A and B, RAGE- and Ki-67-immunohistochemical staining in paraffin sections of breast cancer tissues; C and D, RAGE- and Ki-67-immunohistochemical staining in paraffin sections of lobar breast tumor; E and F, RAGE- and Ki-67-immunohistochemical staining in the inflammatory cells of the adjacent tissues of breast cancer; G and H, negative immunohistochemical staining of RAGE and Ki-67 in the negative control sections; J and K, RAGE- and Ki-67-immunohistochemical staining in the frozen sections of breast cancer; L and M, fuzzy localization of RAGE- and Ki-67-immunoreactive products in frozen sections of breast tumor; N, comparison of RAGE- and Ki-67-immunoreactivities in frozen and paraffin sections of breast tumors; scale bar, 100 μm; **P＜0.01, n=15

讨论

免疫组织化学技术是利用抗原抗体特异性反应发展起来的一项染色技术，已经广泛应用于病理学研究的各个领域，对判断肿瘤的来源、分类、指导临床用药等有着重要的作用[7]。在临床和科研活动中，可以选用石蜡或冷冻切片来进行免疫组织化学检测，但影响实验结果的因素非常多。近年来，使用冷冻切片做术中快速免疫组织化学染色来协助诊断的例子越来越多，而冷冻切片做免疫组织化学的结果和稳定性仍需要进一步探讨。本实验使用了两个在乳腺肿瘤组织中表达比较普遍的胞质蛋白RAGE和胞核蛋白Ki-67作为研究对象，分析其在石蜡和冷冻切片中的差异表达情况，进一步探索冷冻切片用于免疫组织化学检测的适用条件和应用价值。

高级糖基化终末受体RAGE在多种肿瘤组织中表达升高，其在乳腺癌肿瘤组织中的mRNA和蛋白均表达升高[2]。Ki-67是反映细胞增殖的指标，处于增殖期的肿瘤细胞越多，表达越强。本实验结果显示，与癌旁组织比较，RAGE和Ki-67蛋白在所有待测乳腺肿瘤石蜡切片标本中的表达均显著升高，与文献报道一致；我们还观察到，乳腺癌癌旁组织中的炎症细胞里也有少量RAGE和Ki-67的表达，可能与机体对肿瘤的炎性反应有关。

在本研究中，我们使用了现有文献报道的对冷冻切片免疫组织化学有利的各种实验条件。冷冻切片免疫组织化学染色常用的固定液有：95%乙醇、AAF固定液，EAF固定液和冷丙酮等，本次实验中使用了文献报道固定效果较好的EAF固定液，但染色效果不佳。因此，对于冷冻切片的每一种组织或不同抗原所适用的固定液不同，需要反复测试后选用最佳的，与此前文献的结论一致[1]。实验过程中发现，新鲜组织标本中含有大量的内源性过氧化物酶，使用3% H2O2和山羊血清封闭仍有必要，对减轻染色背景意义重大。关于胞膜通透剂的使用上，文献鲜有报道，本研究在冷冻切片的预实验过程中，于阻断内源性过氧化物酶前一步骤使用了0.3% Triton X-100，获得了较好的效果，因此在随后的实验中均使用了胞膜通透剂。一抗与待测抗原的亲和力也是影响实验结果的关键因素，在一些商品化的快速冷冻免疫组织化学试剂盒中，使用了葡聚糖和辣根酶共同标记一抗的技术，既提高了亲和力又缩短了实验过程，显示出良好的染色效果和稳定性[7-9]，但这种情况主要表现在临床病理诊断的常见指标蛋白的检测上，对于常规一抗的冷冻免疫组织化学染色则不太理想。本研究中使用了SP法，一抗的孵育条件设置为37 ℃ 和1 h，在石蜡切片上得到了良好的染色效果；适当增加孵育温度有助于抗原和抗体的结合，在自动化的免疫组织化学染色机中，也利用了相同的设置，以便快速得到实验结果。RAGE和Ki-67在冷冻切片中的表达率（55.33%，66.67%）和表达强度与石蜡切片相比均较低，两者在冷冻切片中的染色还存在抗原弥散，定位不准确，甚至假阴性的现象。两种蛋白的冷冻切片显色不佳，作者认为不在SP法本身，可能是切片的处理方法[8-10]和乳腺肿瘤组织本身的特异性等综合因素造成了以上的差异。

比较蛋白表达强度在以往的研究中一般使用评分法，在本研究中，作者使用了一款图像分析软件来对免疫组织化学切片染色强度进行精确的定量[6]，这样既可以发现染色细微的变化，也减少了人为判读造成的主观因素带来的影响。

综上所述，尽管在保存抗原上有众多优势，但受处理方式和实验条件的影响，使用冷冻切片做科学研究或临床上开展新的抗原免疫组化检测项目时，需要更加的慎重，应该有多次的预实验证据和稳定的实验结果后才可以广泛的推广应用。