食木白蚁肠道降解木质素及环境内分泌干扰物细菌的筛选与特性研究

尚华蓉李成林朱道辰季荣孙建中

(1.江苏大学环境与安全工程学院，江苏 镇江 212013；2.南京大学污染控制与资源化国家重点实验室，江苏 南京 210046)

食木白蚁是一种取食木质纤维素昆虫，能够在24h 内转化木质纤维素中90%以上的纤维素并能同时降解半纤维素和木质素[1]。木质素由于其结构复杂，很难被微生物降解，一直以来被认为是木质纤维素利用的最大障碍[2]。近年来，食木白蚁高效降解木质素的能力引起了研究人员的极大热情和兴趣，并开展了大量研究。Butler等分别以天然和人工的木质素喂养白蚁，证明了白蚁能够消化木质素[3]。此外，木质素降解菌可能同时具有降解EEDs的能力，因此可以从白蚁肠道中筛选环境内分泌干扰物(EEDs)降解菌，为环境生态修复提供技术支持。

本文以木质素及EEDs为底物，从4种食木白蚁肠道内筛选出了33株共13个属的细菌，并比较了不同食木白蚁肠道内木质素及EEDs降解细菌的构成，证实了白蚁肠道细菌参与了木质素及EEDs的降解，为进一步探明食木白蚁对木质素的降解机制提供了更多的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

黄胸散白蚁、黑胸散白蚁和圆唇散白蚁采集于镇江南山景区；台湾乳白蚁由苏州白蚁防治中心提供。本研究所用木质素及衍生化芳香化合物购自Sigma Aldrich公司，EEDs：壬基酚(NP)、双酚A(BPA)、双酚F(BPF)、双酚S(BPS)和四溴双酚A(TBBPA)均由南京大学污染控制与资源化研究国家重点实验室提供。

1.2 木质素及衍生化芳香化合物降解细菌的筛选

在显微镜下用镊子抽取4种低等食木白蚁的肠道各30条，随之放入装有1mL 0.4%无菌NaCl溶液的1.5mL离心管中；然后用高温灭菌后的匀浆器分别将4种低等食木白蚁肠道研磨至均匀悬浮状；用100uL移液器吸取80uL肠道匀浆悬浮液至M9液体培养基中于30℃ 220r·min-1振荡培养；待菌液出现浑浊后，转接到新培养基中，重复此操作3次；最后将菌液在LB固体平板富集并挑取单菌落，最终获得可降解相应木质素及衍生化芳香化合物的菌种。

1.3 16S rDNA序列测定和系统发育树的构建

分离到的细菌总DNA用Wizard@基因组DNA纯化试剂盒提取，16S rDNA产物扩增参考之前方法[4]。PCR产物委托上海生工生物工程有限公司测序。对测序得到的核苷酸序列，在NCBI上进行Blast操作，通过序列比对确定菌属，并采用MEGA 5.05分析软件构建菌种系统发育树。

1.4 筛选细菌碳源利用分析

分别以木质素、衍生化芳香化合物或者EEDs为唯一碳源，在MM63固体平板上接种8种细菌，根据菌种在平板上的生长特征(如菌株数量、菌落大小)，比较8种细菌的生长状况。

2 结果和分析

2.1木质素及衍生化芳香化合物降解细菌的筛选

表1 不同白蚁肠道中筛选出的可降解或利用木质素及其衍生化芳香化合物的细菌属

低等食木白蚁肠道内的木质素及衍生化芳香化合物降解细菌的筛选结果如表2所示。以木质素及衍生化芳香化合物为底物，本研究从4种低等食木白蚁肠道内共筛出了13种菌属，包括无色杆菌属、伯克氏菌属、假单胞杆菌属、特布尔西氏菌属、细杆菌属、潘多拉菌属、雷弗森菌属、阪崎肠杆菌属、苍白杆菌属、伊丽莎白菌属、肠杆菌属、不动杆菌属、噬染料菌属。

2.2 木质素及衍生化芳香化合物降解细菌在低等食木白蚁肠道的构成

台湾乳白蚁肠道中筛出了8种菌属，而黄胸散白蚁肠道内筛出了5种菌属,黑胸散白蚁肠道内筛出了7种菌属,圆唇散白蚁肠道中筛出了5种菌属，见表1。从表1中可知，散白蚁和乳白蚁肠道内主要菌属构成不同,散白蚁肠道内存在着大量可降解木质素及衍生化芳香化合物的伯克氏菌属，而在台湾乳白蚁肠道中只筛选出了1种可降解3,4,5-三甲氧基苯甲醛的伯克氏菌属。在台湾乳白蚁肠道内可降解木质素及衍生化芳香化合物的菌属是细杆菌属，而散白蚁肠道内则较少细杆菌属。

此外，除了伯克氏菌属在3种散白蚁中都存在以外，3种散白蚁肠道内主要菌属构成也有所不同。黄胸散白蚁肠道中，存在着一种假单胞杆菌属，可降解苯甲酸、香草酸、阿魏酸及木质素。无色杆菌属则主要存在于黑胸散白蚁肠道内，可降解3,4,5-三甲氧基苯甲醛、3,5-二甲氧基-4-羟基苯乙酸、香草酸、阿魏酸、3,4-二甲氧基苯丙酸，黄胸散白蚁肠道内也少量存在可降解上述化合物的无色杆菌属。圆唇散白蚁肠道内存在着2种特有的可降解木质素及衍生化芳香化合物的菌属—伊丽莎白菌属、肠杆菌属，其中，伊丽莎白菌属可降解3,5-二甲氧基-4-羟基苯乙酸、苯甲酸、香草酸、3,4-二甲氧基苯丙酸和木质素，而肠杆菌属能降解苯甲酸、香草酸及木质素。

从表1中还可以看出，低等白蚁肠道内虽然存在着大量可降解木质素及衍生化芳香化合物的共生微生物，但却不能有效地降解苯酚类有机化合物，如苯酚、2,6-二甲氧基苯酚。而可降解的香草醛的菌属也仅有伯克氏菌属(存在于黄胸散白蚁、黑胸散白蚁肠道内)。

2.3 木质素及衍生化芳香化合物降解细菌的特性研究

2.3.1 细菌利用木质素及衍生化芳香化合物的生长状况

从表2中可知(碳源编号与表1中木质素及其类似化合物编号一致)，这8种木质素及衍生化芳香化合物降解细菌在一定程度上可有效利用木质素以及6种芳香族化合物，但对于2,6-二甲氧基苯酚、香草醛及苯酚却不能有效利用；菌株YC105C相比其他细菌更能有效地利用木质素及衍生化芳香化合物；通过Blast序列比对发现YC105C菌株与肠杆菌属的菌株相似度为99%，这表明菌株YC105C为肠杆菌属。

2.3.2 木质素降解细菌利用EEDs的生长状况

研究数据表明，低等白蚁肠道内筛选的木质素降解细菌可有效利用NP、BPA、BPF、BPS、TBBPA 5种EEDs作为唯一碳源来生长，见表3。从表3中可知，8种木质素降解细菌均可高效利用NP、TBBPA，而只有少部分菌种可利用NP、BPF、BPS作为唯一碳源来生长，其中菌株Hu109A可高效利用5种EEDs。通过Blast序列比对确定菌株Hu109A为假单胞杆菌属；利用MEGA 5.05分析软件NJ法构建了Hu109A的系统发育树，见图1，发现菌株Hu109A与Pesunomonas guariconensis PCAVU11T的16S rDNA序列相似性为98%，确定菌种Hu109A与P.g PCAVU11T同种。

表3 木质素降解细菌在EEDs上的生长状况

图1 以16S rRNA序列为基础的Pseudomonas sp.Hu109A

3 讨论

低等食木白蚁肠道内存在着大量可降解木质素及衍生化芳香化合物的共生细菌。本研究以木质素及衍生化芳香化合物为唯一碳源从4种食木白蚁肠道内筛选出共13个属的33株细菌，其中细杆菌属、无色杆菌属、特布尔西氏菌属、雷弗森菌属、潘多拉菌属、伊丽莎白菌属、噬染料菌属、苍白杆菌属、不动杆菌属是首次从低等食木白蚁中筛选鉴定的肠道共生细菌[5]，而细杆菌属、无色杆菌属、特布尔西氏菌属、雷弗森菌属、潘多拉菌属、伊丽莎白菌属、噬染料菌属、苍白杆菌属、不动杆菌属、假单胞杆菌属、阪崎肠杆菌属是首次从低等食木白蚁肠道内筛选出的可降解利用木质素及衍生化芳香化合物的菌属。

木质素及衍生化芳香化合物降解细菌在散白蚁和乳白蚁以及不同散白蚁肠道内的构成有所不同。散白蚁肠道内存在着大量可降解木质素及衍生化芳香化合物的伯克氏菌属，而台湾乳白蚁肠道内可降解木质素的菌属是细杆菌属，而圆唇散白蚁肠道内可降解木质素及衍生化芳香化合物的特有菌属则是伊丽莎白菌属、肠杆菌属，这可能是由于食物影响到木质素及衍生化芳香化合物降解细菌在白蚁肠道内的种类和分布[6]；此外，低等食木白蚁肠道共生细菌不能有效利用苯酚、2,6-二甲氧基苯酚，这可能是由于白蚁肠道细菌利用木质素及衍生化芳香化合物的机制有所不同。

通过比较8种不同属的细菌在木质素及衍生化芳香化合物上的生长状况，本研究复筛出1株可高效利用木质素及衍生化芳香化合物的肠杆菌Enterobacter sp.YC105C，而肠杆菌属也被众多研究证明可高效降解木质素及衍生化芳香化合物[7]；假单胞杆菌Pseudomonas sp.Hu109A是首次从黄胸散白蚁肠道内分离鉴定出高效利用NP、BPA、BPF、BPS、TBBPA的假单胞杆菌，也有从水体环境中筛选到可降解EEDs壬基酚、双酚A的假单胞杆菌，表明假单胞杆菌属是一类可高效降解利用EEDs的微生物[8]。

通过食木白蚁肠道共生细菌筛选及其特性研究，本研究初步掌握了4种食木白蚁肠道内共生细菌的构成，并获得了可高效利用木质素及衍生化芳香化合物和EEDs的细菌，这为白蚁肠道降解木质素的机制以及对EEDs的去除提供了更多的参考依据，同时对木质纤维素高效利用以及EEDs的生物治理具有重要的参考价值。