基于超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法测定9 种食品基质中3 种大麻素

唐庆强，叶 洪，陈 迪，杨 方，曹 丹，薛昆鹏

（1.福州海关技术中心，福建 福州 350001；2.三明海关综合技术服务中心，福建 三明 365001；3.福州国际旅行卫生保健中心，福建 福州 350001；4.榕城海关综合技术服务中心，福建 福州 350001；5.金华海关综合技术服务中心，浙江 金华 321001；6.浙江月旭材料科技有限公司，浙江 金华 321001）

大麻素是大麻植物中特有的含烷基及单萜分子结构的一类次生代谢产物，最具代表性的为9-四氢大麻酚（9-tetrahydrocannabinol，9-THC）、大麻二酚（cannabidion，CBD）和大麻酚（cannabinol，CBN）。9-THC因具有使人成瘾和致幻的效果，被联合国《1971年精神药物公约》列为与海洛因、可卡因并列的三大毒品。近年来，多国对大麻的管控政策有所松动。然而，过量摄入9-THC对人体造成的危害和成瘾性带来的社会问题是无法忽视的，许多国家都对食品中9-THC进行了限量控制。在我国，虽然云南等部分地区允许种植9-THC含量＜0.3%的工业大麻（又称汉麻、火麻），并将“火麻仁”列入药食同源产品，但对包括工业大麻提取物在内的其他大麻制品仍加以严格管控。随着各类大麻食品走向市场，特别是欧盟、美国等国对饲料用大麻的合法化，使大麻素通过饲料进入养殖动物，再经食品工业化加工后流入各类食品的可能性大大增加，食品中所含大麻素的来源更为复杂、涉及范围更广且含量更微。

目前检测大麻素的常用方法包括液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法等，但针对的基质多为毛发、血液、尿液和疑似毒品，较少关注食品中大麻素的检测，无法满足当前国际上已出现的多种含大麻素食品的现状。

本实验对照主要国家对食品基质的要求，选取牛肉、牛奶、橄榄油、蜂蜜、面包、巧克力、大豆、饮料和啤酒这9 种有代表性的食品基质，建立基于超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱的方法用于多种食品基质中9-THC、CBD和CBN的同时检测，将对识别含有大麻素的食品和防范风险具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

9-THC、CBD、CBN、9-THC-标准溶液（质量浓度均为0.1 mg/mL） 天津阿尔塔科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯） 德国Merck公司；乙酸铵（色谱纯） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Captiva EMR-Lipid固相萃取柱（100 mg，3 mL）美国Agilent公司；二乙烯苯--乙烯基吡咯烷酮（HLB）固相萃取柱（60 mg，3 mL） 美国Waters公司；其他试剂均为国产分析纯或优级纯；实验用水符合GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》中规定的一级水。

火麻仁、火麻籽、火麻茶、火麻糊、火麻油、火麻膏和火麻粉 广西火麻食品专卖店；牛肉、牛奶、橄榄油、蜂蜜、面包、巧克力、大豆、饮料和啤酒均购自当地超市。

1.2 仪器与设备

Xevo TQD超高效液相色谱-串联质谱联用仪（配有电喷雾离子源） 美国Waters公司；3-18K高速离心机德国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

混合标准溶液：移取适量大麻素标准溶液（9-THC、CBD、CBN），用甲醇稀释配制成1.0 µg/mL的混合标准工作液，于-20 ℃避光保存。

内标溶液：移取适量内标溶液（9-THC-），用甲醇稀释使其质量浓度为1.0 µg/mL，于-20 ℃避光保存。

混合标准工作液：准确移取一定体积的混合标准溶液和内标溶液，用75%甲醇溶液（/）配制成系列质量浓度为10.0、20.0、50.0、100.0 µg/L和200.0 µg/L（分别含50.0 µg/L内标）的混合标准工作液。

1.3.2 样品前处理

1.3.2.1 样品提取

橄榄油：称量2.00 g（精确至0.01 g）样品于50 mL离心管中，加100 µL 1.0 µg/mL9-THC-内标溶液和10 mL乙腈，涡旋混匀30 s，50 ℃超声提取15 min，10 000 r/min离心5 min，取5 mL上清液待净化。

大豆、牛肉、面包、蜂蜜、巧克力：称量2.00 g（精确至0.01 g）样品于50 mL离心管中，加100 µL 1.0 µg/mL9-THC-内标溶液和10 mL甲醇，涡旋混匀30 s，50 ℃超声提取15 min，10 000 r/min离心5 min。取5 mL上清液，加5 mL水稀释后涡旋混匀，10 000 r/min离心5 min，取全部上清液待净化。

牛奶：称量2.00 g（精确至0.01g）样品于50 mL离心管中，加100 µL 1.0 µg/mL9-THC-内标溶液、5 g氯化钠和10 mL甲醇，涡旋混匀30 s，50 ℃超声提取15 min，再加入1 g三氯乙酸，静置15～20 min沉淀蛋白质后，10 000 r/min离心5 min。取5 mL上清液，加5 mL水稀释后涡旋混匀，10 000 r/min离心5 min，取全部上清液待净化。

饮料、啤酒：称量2.00 g（精确至0.01 g）样品于50 mL离心管中，加100 µL 1.0 µg/mL9-THC-内标溶液、5 g氯化钠和10 mL甲醇，涡旋混匀30 s，50 ℃超声提取15 min，10 000 r/min离心5 min。取5 mL上清液，加5 mL水稀释后涡旋混匀后待净化。

1.3.2.2 样品净化

橄榄油：将待净化液转移至事先用2 mL乙腈活化过的Captiva EMR-Lipid固相萃取小柱中，待其自然重力流出后，用5 mL乙腈淋洗小柱，减压抽干30 s。上样和洗脱流速均应小于1 mL/min。收集全部流出液，在40 ℃下氮吹至干，加入1 mL 75%甲醇溶液（/），涡旋混匀30 s，超声3 min，过0.22 µm滤膜后待测定。

其他样品：将待净化液转移至事先用5 mL甲醇和5 mL水活化过的HLB固相萃取小柱中，待其自然重力流出后，用5 mL 50%甲醇溶液（/）淋洗小柱，弃去全部淋洗液并减压抽干30 s，用5 mL乙腈洗脱小柱。上样和洗脱流速均应小于1 mL/min。收集全部洗脱液，在40 ℃下氮吹至干，加入1 mL 75%甲醇溶液（/），涡旋混匀30 s，超声3 min，过0.22 µm滤膜后待测定。

1.3.3 超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱分析

1.3.3.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C（2.1 mm×50 mm，1.7 µm）；流动相：10 mmol/L乙酸铵溶液∶甲醇（2∶8，/）；流速：0.2 mL/min；柱温：室温；进样量：10 µL。

1.3.3.2 质谱条件

电喷雾电离源；正离子模式；检测方式：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；毛细管电压：3 kV；离子源温度：350 ℃；雾化气：氮气；雾化气流速：1 000 L/h；碰撞气：氦气；碰撞气流速：50 L/h；其他参数见表1。

表1 3 种大麻素及内标质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters for three cannabinoids and internal standard

1.4 数据处理

采用Masslynx数据处理系统进行数据采集、分析和处理，采用Origin 9.0和Excel软件进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 色谱柱和流动相的选择

选取Waters的C（2.1 mm×50 mm，1.7 µm）、PFP（2.1 mm×50 mm，1.8 µm）、1-AA（3 mm×75 mm，1.7 µm）、HSS T3（2.1 mm×50 mm，1.8 µm）色谱柱对各目标物的分离和响应情况进行比较。结果表明，使用1-AA、PFP色谱柱时，9-THC和CBD的分离度不理想，使用梯度法也较难分离。HSS T3色谱柱可以较好地分离9-THC和CBD，但对3 种大麻及内标的信号响应值偏低。C色谱柱中3 种大麻及内标的响应值、保留时间以及分离度最好。进一步比较几个不同品牌的C色谱柱，结果没有明显差异。本实验使用Waters ACQUITY UPLC BEH C色谱柱。

此外，还对流动相的组成进行考察，比较用甲醇、乙腈作为有机相，用0.1%甲酸、10 mmol/L乙酸铵、10 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸作为水相的情况。结果显示，用0.1%甲醇作为有机相时，3 种大麻及内标物的信号响应值优于乙腈，且乙腈体系下各目标物的出峰时间过早，甲醇体系下的出峰时间更为合适。以10 mmol/L乙酸铵作为水相时，各目标物的信号响应最好，且等度和梯度洗脱时各目标物的信号响应相当，可选择较为简单的等度洗脱。进一步比较有机相体积分数为70%、75%、80%、85%时各目标物的信号响应和分离情况，发现在80%有机相条件下，3 种大麻及内标物有最好的信号响应和分离情况。为获得更好的信号响应值，还比较了3 种大麻及内标物用60%、75%、80%甲醇溶液（/）配制后信号响应情况，结果表明，3 种大麻及内标物用75%甲醇溶液配制成的标准工作液具有最好的信号响应值，如图1所示。

图1 Δ9-THC（a）、CBD（b）、CBN（c）和Δ9-THC-D3（d）MRM色谱图（200 μg/L混合标准工作液）Fig.1 MRM chromatograms of Δ9-THC (a),CBD (b),CBN (c),and Δ9-THC-D3 (d) (in mixed standard solution at 200 μg/L)

2.2 提取条件的优化

选取甲醇和乙腈这两种文献中检测大麻最常用的提取溶剂，对天然含有9-THC、CBD、CBN的火麻油、火麻仁和火麻茶样品进行提取，用峰面积比较提取效果。从图2a可以看出，乙腈溶剂对油类样品中3 种大麻素的提取效果高于甲醇，其他样品则是甲醇优于乙腈。为验证这一结论，进一步使用空白样品加标的方法比较两种溶剂的提取效果（图2b），结果表明，使用乙腈提取油脂类样品和使用甲醇提取其他种类的样品时，提取率均达到90%以上。

图2 不同提取溶剂（a、b）和提取方式（c）的提取效果比较Fig.2 Comparison of extraction efficiency of different extraction solvents (a and b) and extraction methods (c)

此外，还比较了不同提取方式的效率，分别比较了涡旋提取、均质提取和超声提取的情况。由图2c表示，在相同提取时间下，超声方式对3 种大麻素的提取效率均高于90%，优于涡旋振荡和均质提取的效率。继续对超声提取的时间和温度进行优化，结果表明，当超声时间大于15 min时，3 种大麻的峰面积基本不再增加，超声温度高于50 ℃时，峰面积趋于稳定。因此，本实验最终选择用乙腈和甲醇作为油类和其他食品基质的提取溶剂，50 ℃超声15 min的提取方式。

2.3 净化方法的优化

根据目标化合物的极性和结构特点，采用空白样品加标的方式，将中性氧化铝小柱（Alumina-N）、Captive EMR-Lipid小柱和凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）净化方法应用于橄榄油样品并进行比较。将石墨化炭黑/炭基（Carb/NH）、HLB、石墨化炭黑/硅胶键合-丙基乙二胺（GCB/PSA）固相萃取小柱净化和QuEChERS（PSA+C+柠檬酸钠+柠檬酸二钠）基质分散萃取净化方法应用于其他基质样品并进行比较。

从图3a可以看出，对于油类基质样品，Alumina-N小柱回收率一般，EMR小柱和GPC净化方法都能取得较好的回收率，但GPC净化操作繁琐，且需额外增加凝胶渗透色谱仪设备。由图3b可知，其他基质的样品中，HLB小柱的回收率明显优于其他类型的小柱。因此，本实验选择EMR、HLB小柱分别作为油类和其他基质样品的净化小柱。在此基础上，还进一步比较了不同品牌小柱及甲醇、乙腈作为淋洗液和洗脱液时的情况，并据此优化了淋洗液的体积、体积分数和上柱时的溶剂组成。结果表明，使用不同体积的溶液和不同品牌的小柱时，结果间存在一定差异，使用5 mL乙腈淋洗Captiva EMR-Lipid小柱和使用5 mL 50%甲醇溶液（/）作为Waters HLB小柱的洗脱液时，能达到较好的回收率和净化效果。

图3 不同净化方式对橄榄油样品（a）和其他基质样品（b）的净化效果Fig.3 Comparison of purification efficiency of different purification methods for olive oil sample (a) and other matrix samples (b)

2.4 基质效应（matrix effect，ME）和定量方法的选择

不同基质对目标物的影响会产生不同的ME，进而影响结果的准确度。参考González等的方法，使用甲醇配制的标准溶液的标准曲线斜率（）和用空白基质配制的相同浓度样品得到的标准曲线斜率（）进行比较，按ME/%＝（-）/×100计算各种样品的ME，并分别比较了内标和外标法定量时的ME，如表2所示。

表2 不同样品的METable 2 ME for different samples %

根据判断标准，当|ME|＜20%时为弱ME，当20%＜|ME|＜50%时为中等强度ME，|ME|＞50%时为强ME。从表2可以看出，使用外标法定量时各种基质大多呈现中等强度的ME，而用内标定量后所有基质ME均有所变化，均在弱ME的范围里，这与同位素内标具有校准ME的结论相符。因此，本实验使用9-THC-作为内标，并用内标法定量各样品含量。

2.5 超高效液相色谱-串联质谱法的标准曲线、检出限和定量限分析

将3 种大麻素的混合标准工作液，在最优前处理和色谱条件下，按质量浓度由低到高的顺序进样分析。以3 种大麻素化合物及其对应氘代同位素内标的峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，从而获得线性方程和相关系数（）。如表3所示，3 种大麻素的均不小于0.998，说明其在10.0～200.0 µg/L质量浓度范围内有良好的线性关系。在各空白样品提取、净化处理后的样液中添加0.001～0.02 mg/L的3 种大麻素标准溶液，按优化后的仪器条件测定，以定量离子信噪比为3和10时的响应为方法的检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）。根据信噪比的结果，部分种类基质样品的LOD和LOQ可以更低，但考虑到操作上的便捷和使用时的方便，基于最不灵敏化合物的LOD和LOQ进行了统一，3 种大麻素的LOD和LOQ分别为3 µg/kg和10 µg/kg，该LOQ能够满足世界各国对食品中大麻素的限量要求。

表3 3 种大麻素的回归方程、相关系数、检出限和定量限Table 3 Regression equations,correlation coefficients (R2),LODs and LOQs of three cannabinoids

2.6 超高效液相色谱-串联质谱法的准确度和精密度分析

对不含待测物的橄榄油、大豆、牛肉、面包、牛奶、蜂蜜、巧克力、啤酒和可乐等9 种空白样品进行加标回收实验，设置10.0、20.0、100.0 µg/kg的添加水平，考察方法的准确度和精密度。由表4可知，3 种大麻素的回收率为71.7%～108.5%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为4.6%～12.4%，方法准确度和精密度良好，能满足分析要求。

表4 3 种大麻素在不同食品中加标回收率和RSD（n＝6）Table 4 Recoveries and RSDs of three cannabinoids in different spiked foods (n=6)

续表4

2.7 超高效液相色谱-串联质谱法的实际样品分析

应用本实验建立方法对市场购买的16 种火麻食品进行测定，包括火麻茶、火麻油、火麻膏、火麻糊、火麻粉、火麻仁和火麻籽等。由表5可知，大部分样品中均不同程度地检出了大麻素，其中火麻油中大麻素的整体含量最高；不同品牌火麻油或火麻茶中3 种大麻素含量差别较大，这可能与原料、产地、大麻籽用量等有关；但全部样品的9-THC含量均满足欧盟或加拿大等主要国家对大麻食品中9-THC的限量要求（10 mg/kg）。

表5 实际样品中3 种大麻素类化合物含量Table 5 Contents of 3 kinds of cannabinoids in real samples µg/kg

3 结论

建立了固相萃取-同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱法，测定9 种代表性的食品基质中3 种大麻素的检测方法。建立的方法回收率和精密度良好，线性范围广，重复性好，LOQ能满足国内外对食品中大麻素的限制要求，可作为快速的定性和定量分析方法侦测食品中的大麻素含量。此外，还使用同位素内标和多种固相萃取小柱净化，优化了多种食品检测时的基质效应，从而为我国开展食品中大麻素类化合物含量的安全评价提供技术支持。