表面增强拉曼光谱法灵敏检测亚硫酸根离子

2022-10-31高月滢万玉琪刘婧涵李靖坤皮付伟

食品科学 2022年20期

高月滢，万玉琪，刘琳，刘婧涵，李靖坤，皮付伟

（江南大学食品科学技术学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122）

亚硫酸盐具有多种防腐性能，可以抑制微生物生长、防止褐变，并具有抗氧化和漂白作用，被广泛用作食品防腐剂。此外，亚硫酸盐在药物中还具有维持药物稳定性和效力的作用。由于这种广泛应用的历史，在合适的剂量内，亚硫酸盐通常被认为安全，但仍有小部分人群对亚硫酸盐敏感。其敏感性临床表现包括皮肤疾病、呼吸系统疾病以及胃痉挛等胃肠道过敏反应。此外，高浓度的亚硫酸盐摄入甚至会导致休克等。其中，哮喘患者是亚硫酸盐敏感症的高发人群，尤其是类固醇依赖性哮喘患者。Küçükatay等也提出亚硫酸盐会提高大鼠脊髓反射的兴奋性，进而对神经系统造成严重损伤。因此，食品中亚硫酸盐的使用成为消费者和监管机构重点关注的问题。美国食品药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）要求含有10 mg/kg亚硫酸盐的食品需在成分标签中进行标注，并禁止在新鲜水果和蔬菜及肉类食品中使用亚硫酸剂。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）提出每日可接受的亚硫酸盐的摄入量为0.7 mg/kg。中国严格规定白砂糖中亚硫酸盐含量需低于100 mg/kg。

目前，已经建立了许多用于亚硫酸盐检测的分析技术，例如滴定法、荧光光谱法和色谱法等，但这些检测方法耗时长且需要复杂的测试仪器。表面增强拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）光谱作为一种超灵敏的分子传感技术，由于其对多分子的即时信息获取能力已被广泛应用于环境监测、生物医学和食品科学等领域。与有机分子不同，大多数无机离子不能直接产生拉曼信号，因此一般通过无机离子的特异性探针对其进行捕获。此外，开发用于识别和检测各种离子的专用传感器也是当前SERS技术的热点之一。探针分子与无机离子的结合会改变其分子结构，导致分子振动特性的改变，因此可以监测探针分子与阴离子识别产生的SERS光谱变化间接实现对特定阴离子的检测。然而，与稳定的阳离子不同，大尺寸的阴离子具有广泛的几何形状和更弥散的性质，这需要探针分子对目标阴离子具有更高的互补性以获得良好的选择性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柠檬酸钠（98%）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES，98%）美国Sigma-Aldrich公司；4-巯基苯硼酸（90%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化钾、硝酸钾、溴化钾、亚硫酸钾、亚硝酸钠、磷酸二氢钾、硝酸银、氢氧化钾（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司；氮气（N，纯度≥99.99%）无锡太湖气体公司；0.22 μm微孔滤膜（水系）南通海之星实验器材有限公司；超亲水盖玻片德国Karl-Hecht公司。

1.2 仪器与设备

超纯水纯化系统美国Millipore公司；Dxr2xi共聚焦拉曼显微镜美国赛默飞生物技术有限公司；等离子体清洗机德国Diener公司；JEM-2100场发射透射电子显微镜、SU-8230场发射扫描电子显微镜日本电子株式会社。

1.3 方法

1.3.1 银纳米颗粒（silver nanoparticles，AgNPs）的合成

AgNPs按照柠檬酸钠还原策略合成。即在600 r/min磁力搅拌下将2 mL、质量分数1%的柠檬酸三钠加入沸腾的AgNO溶液（1×10mol/L，100 mL）中煮沸1 h。溶液颜色逐渐变为黄绿，冷却至室温后置于4 ℃避光保存作为储备液。

1.3.2 4-MPBA修饰的AgNPs（4-MPBA@AgNPs）芯片的制备

玻璃盖玻片分别用超纯水和无水乙醇超声清洗30 min，放入等离子体清洗机进行羟基化处理。随后，将APTES通过气相沉积修饰在玻璃衬底上，从而完成基底的硅烷化处理。将硅烷化衬底浸入10 倍浓缩的AgNPs胶体中反应4 h，通过Ag-N键将AgNPs固定在玻璃衬底上，得到单层的AgNPs基底。将AgNPs芯片浸泡在4-MPBA乙醇溶液（1×10mol/L）中过夜，随后用乙醇彻底冲洗，即得到4-MPBA@AgNPs芯片（图1）。

图1 4-MPBA@AgNPs芯片制备的流程图Fig.1 Flow chart of the fabrication of 4-MPBA@AgNPs chip

配制0.01 mol/L的KSO标准溶液，并将其进行连续稀释，得到一系列浓度梯度的KSO标准待测液。随后，向待测样品中滴加适量的高浓度氧化剂，振荡摇匀并静置反应，使得KSO完全转化为KSO。调节样品溶液pH值至中性，然后将在1.5 mL的样品溶液滴加在4-MPBA@AgNPs芯片表面，充分反应10 min。

反应后的4-MPBA@AgNPs基底从氧化液中取出，自然晾干后进行拉曼检测。测试参数：激发波长532 nm，激光功率2.0 mW，曝光时间0.01 s，10 次积累。实验中对所有4-MPBA光谱的SERS基线校正光谱在1 070 cm处进行归一化处理。误差棒表示基于10 个独立测量值的标准差。

1.3.4 实际样品检测

白糖参照SN/T 2918—2011对其进行预处理。将4 g样品溶解在100 mL水中并加入2 mL的NaOH溶液（1 mol/L）。摇匀后9 000 r/min离心30 min。使用0.2 μm滤膜将上清液过滤并再次使用超滤管离心。使用最佳氧化条件对加标样品进行处理，反应后调节pH值至中性。随后将样品引入反应体系进行SERS图谱采集。相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）基于10 次平行测量值。

2 结果与分析

2.1 基于4-MPBA@AgNPs芯片的检测机理

图2 4-MPBA@AgNPs芯片检测的示意图Fig.2 Schematic illustration of detection by 4-MPBA@AgNPs chip

图3 不同pH值环境下4-MPBA（a）和与共存溶液中4-MPBA（b）的紫外吸收光谱Fig.3 UV-vis absorption spectra of 4-MPBA in the absence (a) or presence (b) of under different pH environments

2.2 AgNPs的表征

参照传统的柠檬酸三钠还原法成功制备AgNPs，对其紫外特征吸收峰进行表征。如图4所示，AgNPs在波长407 nm处显示出较强的特征吸收峰。此外，其紫外吸收峰的半峰宽较窄，说明AgNPs的粒径尺寸较为均匀。进一步，使用透射电子显微镜对AgNPs的形貌进行表征（图4b），可以看出合成的AgNPs粒径分布均匀，且呈现出良好的颗粒形态与分散性。

图4 AgNPs的紫外可见吸收光谱（a）和透射电镜图（b）Fig.4 UV-Vis absorption spectrum (a) and TEM image (b) of AgNPs

2.3 AgNPs基底的制备与表征

选用玻璃盖玻片作为衬底，界面羟基化使衬底获得良好的亲水性，也促使APTES修饰在衬底表面以完成硅烷化处理。最后将AgNPs滴加在硅烷化衬底表面孵育4 h，通过Ag-N键固定在衬底表面，得到单层AgNPs基底。如图5所示，AgNPs通过与APTES的氨基基团反应而嫁接到玻璃基底上，形成AgNPs均匀分布的单层AgNPs基底。

图5 AgNPs基底的扫描电镜图Fig.5 TEM image of AgNPs substrate

2.4 4-MPBA@AgNPs芯片的表征

通过Ag-S键将4-MPBA探针分子修饰到AgNPs表面，得到4-MPBA@AgNPs芯片。如图6、表1所示，在4-MPBA的SERS光谱中，由于S—H拉伸振动（（SH））产生的2 563 cm波段的峰完全消失，证明4-MPBA分子通过Ag—S键被成功修饰到AgNPs表面。此外，归属于C—S—H弯曲带模式（（CSH））的911 cm处的峰也在SERS光谱中消失（图6中的b），同样证明了Ag—S键的形成。