惠水县鸡场的大肠杆菌耐药情况调查分析

马卫红， 龚才伟， 陈启青， 杨志艳， 罗德彪， 刘永怀， 彭庆波， 赵福琼*

(1. 惠水县农业农村局，贵州惠水550600； 2. 黔南州养殖业发展中心，贵州都匀558000)

大肠杆菌(又称大肠埃希氏菌)是1种典型的革兰氏阴性杆菌[1]。该菌一般分为致病性和非致病性(或条件致病性)，在环境中广泛存在，常作为环境、食品、饮水污染的指标细菌[2，3]。多年来，抗菌药物在畜禽养殖中普遍使用，存在使用不规范、不合理甚至滥用的现象[4]。一方面促使细菌产生耐药性，从而加大抗菌药的使用量，对生活环境造成严重污染；另一方面，动物产品中抗菌药物残留，对公共卫生安全带来严重隐患[5]。笔者通过对贵州省惠水县鸡场及兽药店抗菌药物的使用和销售情况进行调研，根据调研结果选择部分常用的抗菌药物进行大肠杆菌耐药情况检测，为鸡场规范合理使用抗菌药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源2021年5—12月，从全县11个乡镇(街道)的16个鸡场随机无菌采集鸡口咽和泄殖腔双棉拭子，每场5份，共80份，24 h内进行细菌分离培养鉴定。

1.2 主要试剂麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、抗生素药敏纸片(均购于杭州微生物试剂有限公司)；Hifiscript cDNA Synthesis Kit(北京康为世纪生物科技有限公司)、核酸提取试剂盒(西安天隆科技有限公司)、Gold ViewⅠ型核酸染色剂(北京索莱宝科技有限公司)、琼脂糖(兰杰柯有限公司)。

1.3 主要仪器电子天平(型号：JA2003，上海上平仪器公司)、相称显微镜(型号：ZYX300E，上海兆仪光电科技有限公司)、恒温培养箱(型号：PR-BYX9082，上海普瑞赛斯仪器有限公司)、PCR仪(型号：StepOnePlus，赛默飞世尔科技公司)、全自动核酸提取仪(型号：NP968-C，西安天隆科技有限公司)、双稳定时电泳仪(型号：DYY-6C，北京六一生物科技有限公司)、蓝光切胶仪(型号：BL-18，兰杰柯有限公司)。

1.4 细菌分离培养将采集的鸡口咽和泄殖腔双棉拭子样品分别浸入无菌生理盐水1 mL，洗脱液采用平板划线法接种于麦康凯琼脂培养基，37 ℃培养24 h，观察菌落生长情况。挑取典型菌落(粉红色、圆形、光滑)进行革兰氏染色，显微镜下观察细菌形态。将典型菌落采用平板划线法分别接种于麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、营养琼脂培养基，37 ℃培养24 h，观察菌落形态。再从麦康凯琼脂培养基上将典型菌落接种于营养琼脂培养基，37 ℃纯化培养24 h。

1.5 细菌PCR鉴定参考相关文献[6]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成细菌16S rDNA通用引物。27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(Tm：54.2 ℃)；1492R：5’-GGTTAACCTTACGACTT-3’(Tm：48.6 ℃)；预扩增片段约1 400 bp。以各分离菌纯培养物为模板进行PCR鉴定。反应体系50 μL：Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，DNA模板5 μL，无菌水补足50 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性50 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共31个循环；72 ℃终延伸10 min。 扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，结果与GenBank数据库中的大肠杆菌基因序列进行同源性(BLAST)比对。

1.6 细菌药敏试验按照《抗菌药物敏感性试验的技术要求》(WS/T 639—2018)，将纯化培养的单个菌落接种于1.5 mL营养肉汤培养基内，37 ℃培养16～18 h，用灭菌棉签蘸取菌液均匀涂布在营养琼脂培养基上，待培养基表面水分吸干后，用眼科镊取8种药敏纸片紧贴于培养基表面，37 ℃培养16～18 h，测量抑菌圈直径。判定敏感(S)、中敏(I)、耐药(R)情况(见表1)。

表1 大肠杆菌耐药判定标准

2 结果与分析

2.1 分离细菌特征麦康凯琼脂培养基上生长菌落为粉红色、圆形、湿润、表面光滑、半透明、边缘整齐(见图1)；伊红美蓝琼脂培养基上生长菌落为紫黑色、有金属光泽(见图2)；普通琼脂培养基上生长菌落为白色、圆形(见图3)。挑取典型菌落，经革兰氏染色，油镜(×1 000)下观察为革兰氏阴性、两端钝圆的小杆菌(见图4)。

图1 麦康凯琼脂培养基菌落 图2 伊红美兰琼脂培养基菌落 图3 普通琼脂培养基菌落

图4 菌体形态(×1 000)

2.2 细菌PCR鉴定结果PCR扩增产物长度约1 400 bp，经测序为1 446 bp，与预期片段基本相符(见图5)。基因序列BLAST比对，分离菌与大肠杆菌的同源性为99.58%，鉴定为大肠杆菌。

2.3 细菌耐药情况从16个鸡场共分离到66株大肠杆菌，对阿莫西林耐药率最高，其次分别为复方新诺明、氨苄西林、奥格门汀，且耐药鸡场数较多；对链霉素、庆大霉素、头孢克洛、多西环素耐药率相对较低，耐药鸡场数也较少。其中多个鸡场出现多重耐药情况(见表2、表3)。

M：DL 2 000 DNA Marker； 1～7：分离菌株(部分)； -：阴性对照图5 分离菌16S rDNA PCR扩增

表2 大肠杆菌耐药情况

表3 各鸡场耐药情况

3 结论

本次从惠水县16个鸡场分离的66株大肠杆菌耐药较普遍，对阿莫西林、复方新诺明、氨苄西林、奥格门汀耐药率较高，对链霉素、庆大霉素、头孢克洛、多西环素耐药率较低，多个鸡场存在多重耐药现象。

4 讨论

近年来，抗菌药物滥用导致的细菌耐药已引起我国及国际社会的广泛关注[7]。据报道，我国2013年抗生素总使用量达到10万t，其中兽用抗生素占总量的52%[8]。抗生素在畜牧、水产等农业生产中发挥了重要作用，然而滥用或不规范使用容易使细菌产生耐药[9]，同时也对环境造成严重污染。本试验从惠水县鸡场分离的66株大肠杆菌对β-内酰胺类的阿莫西林、氨苄西林，以及奥格门汀(阿莫西林与克拉维酸复合制剂)、磺胺类的复方新诺明耐药率较高。与全国耐药细菌监测网2014—2019年细菌耐药监测报告相比[10]，惠水县分离菌株对氨苄西林的耐药率(81.82%)比全国2019年(83.06%)略低，庆大霉素的耐药率(36.36%)比全国2019年(37.3%)略低。检测结果说明惠水县鸡场大肠杆菌的耐药较普遍，但各个鸡场耐药情况差异较大，可能与不同的饲养管理有关。养殖场应根据药敏试验结果科学选择抗菌药物种类，严格控制用量，科学制定给药方案，避免在养殖过程中盲目滥用抗菌药。