罗曼粉蛋鸡感染E亚型禽白血病病毒的分子生物学检测分析

何建宇， 孙 芸，2， 徐 飞，2， 罗东还，2， 张小波，2， 吴诗卉， 冉 凤， 龙小川， 王廷龙， 李 涛， 温贵兰，2*

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025； 2. 贵州省动物生物制品工程技术研究中心，贵州贵阳550016； 3. 贵州省动物疫病预防控制中心，贵州贵阳550008)

禽白血病是由反转录病毒科、α反转录病毒属的禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)引起的禽类肿瘤疾病[1]。根据血清中和试验、宿主范围、囊膜糖蛋白特性等，ALV可分为A～K 11个亚群[2，3]。根据自然传播方式与病毒复制的生物学特性，ALV又可划分为外源性病毒和内源性病毒，其中A、B、C、D、J、K为外源性病毒，E、F、G、H、I为内源性病毒。通常情况下，E亚群ALV无致病性或致病性较弱[4]，但会影响外源性ALV的检测，造成结果误差[5]。由于外源性ALV与内源性ALV同时存在的情况时有发生，也极易造成不同亚群之间的基因重组[6]。2021年11月1日，贵州省惠水县某养殖场的罗曼粉蛋鸡出现死亡现象，3天内共死亡89只，产蛋率下降7%。现将养殖场送检的10只病死鸡进行禽白血病病毒排查检测情况报道如下，供参考。

1 材料与方法

1.1 检测病料采集10只送检病死鸡的肝脏、脾脏(分别编号1～10)作为检测病料。

1.2 主要试剂2×EsTaqDNA聚合酶(购自康为世纪有限公司)、RNA提取试剂盒(购自世纪元亨公司)，反转录试剂盒、DL 2 000 DNA Marker[均购自宝生物工程(大连)有限公司]。

1.3 主要仪器高速冷冻离心机(型号：TGL-18M，上海卢湘仪离心机仪器有限公司)、基因扩增仪(型号：T20，杭州朗基科学仪器有限公司)、电泳仪(型号：DYY-8C，北京市六一仪器厂)。

1.4 引物设计ALVp27基因是ALV各亚群的高度保守基因，内源性和外源性病毒中均存在。P27蛋白是ALV群特异性抗原，是ALV核心衣壳蛋白的主要成分，含量高，占病毒总蛋白的30%以上，是制备检测抗体的首选抗原[7]。因此本试验参考徐丽等[8]的方法，利用Primer Premier 7.0软件设计ALVp27基因的通用扩增引物。按照张喜懿等[9]的方法，参照GenBank中ALV-A(登录号：MF926337)、ALV-B(登录号：M14902)、ALV-K(登录号：KP686142)的p27基因序列，以及ALV-J(登录号：Z46390)的gp85基因序列，分别设计A、B、J、K亚型ALV核酸检测扩增引物。按照黄新[10]的方法，参照ALV-E(登录号：KF746200)的p27基因序列设计E亚型ALV核酸检测扩增引物。各引物信息见表1。

表1 引物信息

1.5 ALV核酸检测液氮条件下研磨肝脏、脾脏，按照RNA提取试剂盒说明书方法提取总RNA，按反转录试剂盒明书方法合成各病毒cDNA。反转录体系：dNTP Mix 4 μL、Primer Mix 2 μL、RNA Template 4 μL、5×RT Buffer 4 μL、DTT 2 μL、HifiScript 1 μL、加入RNase-Free Water补足至20 μL。反转录程序：42 ℃ 45 min，85 ℃ 5 min。反转录产物-20 ℃保存备用。以各cDNA为模板进行PCR检测。PCR反应体系25 μL：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件见表2。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

表2 PCR反应条件

1.6 ALV-E的遗传进化分析将扩增产物送至上海生工生物有限公司测序。测序结果上传至 NCBI(美国国立生物技术信息中心)、BLAST(生物大分子序列比对搜索工具)进行比对，以GenBank中11株ALV各亚型毒株为参考株，利用生物信息分析软件MegAlign 7.1进行同源性分析，并构建系统进化树。参考毒株信息见表3。

表3 参考毒株信息

2 结果与分析

2.1 ALV核酸检测结果PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离后，1、2、3、5、6、9号病料在744 bp处出现特异性条带，说明10只病死鸡中有6只存在ALV感染(见图3)。6份阳性样品经ALV-E亚型检测同样在1 074 bp处出现特异条带(见图4)。

2.2 遗传进化分析将鸡场分离的病毒株(命名为：HS202101S株)与11株ALV参考株进行同源性分析，结果HS202101S毒株与ALV-E亚型的E-ros001、E-B9、E-TYR毒株同源性最高，均为99.1%；与ALV-J亚型的GZN16毒株同源性最低，为37.1%；与其他亚型毒株同源性均相对较低，为37.3%～41.2%。 构建HS202101S毒株与11株ALV参考毒株的系统进化树，由图5可见：HS202101S毒株与E-ros001、E-B9、E-TYR属于1个小分支，进化关系最近。

M：DL 2 000 DNA Marker； -：阴性对照； +：阳性对照； 1～10：检测样品图3 ALV核酸PCR检测

M：DL 2 000 DNA Marker； 1～6：检测样品； +：阳性对照； -：阴性对照图4 ALV-E核酸PCR检测

图5 ALV系统进化树分析

3 结论

经实验室分子生物学检测分析，贵州省惠水县某养鸡场存在ALV-E感染。

4 讨论

4.1本次检测旨在排查惠水县某养鸡场的罗曼粉蛋鸡是否存在ALV感染，结果表明在没有特征症状情况下，6只鸡存在ALV-E内源性感染。内源性ALV是存在于鸡染色体基因组上的 ALV前病毒基因组或片段，可随染色体的复制而垂直传播，致瘤性很低。外源性 ALV 通常不通过宿主细胞染色体传递给下一代[11]，可诱发肿瘤，可垂直和水平传播。

4.220世纪90年代，我国首次分离到外源性ALV-J，主要是从国外引进白羽鸡所致，随后国内养殖的黄羽鸡、蛋鸡及地方品种鸡陆续被各型ALV感染，并造成严重的经济损失，其中引起鸡发病死亡的主要是外源性ALV。大部分鸡的染色体基因组中存在ALV的前病毒DNA，宿主体内的ALV-E在一定条件下可产生完整的病毒粒子或表达某些特征蛋白质。携带完整ALV-E病毒粒子的鸡往往对其他外源性ALV 的抵抗力较差，更容易发生外源性 ALV 诱发的禽白血病肿瘤[11]。ALV-E 基因座遵循孟德尔遗传方式，很多ALV-E原病毒是不完整或转录沉默的，但仍然有一些完整的、能够活跃转录并产生感染性病毒的元件存在，这些具有转录活性元件的ALV-E会影响鸡的产蛋量和蛋重等重要的经济特征；此外，携带ALV-E21毒株的低羽鸟类与正常羽鸟类相比，产量较低，死亡率较高[12]。综上所述，对于E亚型禽白血病病毒的研究也应当引起重视。