硫酸盐还原菌法固定酸性矿山废水中重金属的研究进展

闻倩敏，秦永丽，郑君健，韦巧艳，张媛媛，蒋永荣

（桂林电子科技大学生命与环境科学学院，广西 桂林 541004）

酸性矿山废水（acid mine drainage，AMD）是采矿业所面临的最严重的环境问题之一，其主要来源于采矿过程中矿井内的天然溶滤水、选矿废水、选矿废渣堤堰的溢流水以及矿渣堆积场的浸出水等，此类废水的pH通常低至3.0以下，富含硫酸根离子（SO）、铁离子（Fe、Fe）及一定浓度有毒金属离子（如Pb、Cu、Zn、Cd等）。在我国，AMD 年排出量占全国工业废水总排放量的10%，但仅有不到5%的处理率。未经处理的AMD 往往对周围水域、土壤和生物多样性造成严重污染和破坏，并且重金属离子通过食物链进入人体会对健康产生巨大危害。因此，探索和寻求行之有效的AMD 治理方法与技术显得尤为必要和紧迫。这对矿区农业和经济的持续发展、保障当地居民的身心健康具有重要意义。

传统的AMD 治理方法如化学法、物理法和物理化学法等，大多具有成本高、易产生二次污染等缺点；而微生物法由于具有高效性、低能耗和环境友好等优势，受到了研究人员的关注，其中的硫酸盐还原菌（sulfate-reducing bacteria，SRB）法更是吸引了广大研究者的目光，成为目前研究的热点。利用SRB产生的硫化物沉淀废水中的重金属不仅成本低、无二次污染，还能回收有用金属，实现资源再利用，是一种极具潜力的生物处理AMD 技术。大量文献也表明SRB 处理AMD 效果显著，但是存在两方面原因制约了SRB 法在AMD 治理中的工程化应用。一方面是pH 对各类金属离子去除效果的影响非常大，另一方面厌氧过程中金属沉淀夹带污泥不易分离，最后由于金属沉淀物大量积累导致厌氧反应器运行失败。

事实上，如何将多种重金属分级沉淀并且分相分离出来，是SRB 工艺能够稳定运行的关键，也是采用SRB法处理AMD的环保工作者面临的难题。目前，关于SRB 法处理AMD 的研究主要集中在不同重金属的处理效果、去除机理、影响因素和工艺技术等，对于多种重金属的分级沉淀与持久性矿化固定缺乏系统分析。因此，本文对该领域的研究进行综述，分析其存在的问题，并对今后的研究发现提出建议。

1 SRB法去除酸性矿山废水中重金属的原理

2 SRB法分级沉淀酸性矿山废水中多种重金属的工艺

pH 对各类金属离子去除效果的影响非常大，这是因为各种金属硫化物的和起始沉淀pH不同（见表1）。为解决这一问题，研究者不断改进工艺和开发新型反应器，发现通过分级pH 控制，可以在SRB 处理AMD 的过程中实现对各种重金属的分级沉淀和选择性回收。其中生物反应与化学沉淀分离式多级pH 控制工艺和多隔室厌氧折流板反应器（anaerobic baffled reactor，ABR）工艺备受关注。

表1 酸性矿山废水中主要重金属硫化物的Ksp和沉淀起始的pH条件

2.1 分离式多级pH控制工艺

生物反应与化学沉淀分离式多级pH 控制工艺可将硫酸盐还原厌氧反应器和金属硫化物沉淀池分置，AMD 不直接与SRB 接触。这种工艺首先在硫酸盐还原厌氧反应器中将SO还原为HS，然后利用载气（如N）吹脱反应器中的HS 到AMD 沉淀池，同时在AMD 沉淀池逐级加碱从而控制多级pH，由此实现对各种重金属的分级沉淀和选择性回收。为了获得更佳的沉淀效果，提高各种重金属的处理效率，国内外研究者利用了不同类型的分离式工艺装置开展试验（详见表2），从而获得较优的处理参数，对金属离子的沉淀率高达90%以上。

表2 分离式多级pH控制的工艺应用

分离式多级pH 控制工艺的独特之处在于，它允许生物产硫化物系统和金属沉淀系统作为两个独立的单元并行运行，并通过逐级加碱等方式分类回收AMD 中的重金属离子。但是该工艺载气再循环需要高能量输入、多段式工艺复杂以及逐级加碱等增加成本。

2.2 厌氧折流板反应器工艺

ABR 集上升流厌氧污泥床（UASB）和分阶段多相厌氧反应技术（SMPA）于一体，是一种理想的多段分相、混合流态处理工艺，运行中的ABR 是一个整体为推流、各隔室为完全混合的反应器，从而使具有不同营养生态位的功能菌群依次分布在反应器各隔室中，形成良好的功能分区，即微生物相分离特性。本文作者课题组采用五隔室ABR 处理硫酸盐有机废水，沿程形成明显的多生物相分离，反应器前、中、后端的pH 分别为4.0～4.5、5.5～6.0 和7.0 左右，在不加碱或少量加碱条件下，可为AMD 中不同重金属沉淀提供良好的pH 梯度。Sahinkaya 课题组利用四隔室ABR 针对AMD 中重金属去除进行了研究，通过调控各项参数优化反应器运行性能，能够同时去除COD、SO和多种重金属（Co，Cu，Fe，Ni 和Zn），X 射线荧光光谱（XRF）分析结果表明，污泥中存在一定量的金属硫化物。这为利用ABR 硫酸盐还原体系处理AMD 并分级沉淀各种重金属提供了可能。

近年来，利用ABR 硫酸盐还原体系处理AMD并分级沉淀各种重金属的研究见表3。与分离式多级pH控制工艺相比，ABR 工艺设计简单，成本较低，能有效截留生物体，集生物产硫系统和金属沉淀系统于一体，处理AMD 时可以在一个反应器内实现硫酸盐还原、金属去除、碱度生成和过量硫化物氧化，是一种高效的厌氧反应器。其中大部分金属在前面隔室便可形成沉淀除去，而不会对反应器的运行造成严重的损害，通过这种方式，有价值的金属能在不中断反应器运行的情况下回收利用。此外，ABR 生产的硫化物可以部分氧化为单质硫，实现硫回收，避免有害硫化物排放。

表3 多隔室厌氧折流板反应器在重金属废水中的工艺应用

值得注意的是，上述研究大多偏重于调控反应器运行参数去除重金属，并未对污泥中金属硫化物沉淀的持久性矿化固定进行系统分析。

3 SRB法厌氧污泥中金属硫化物的生物矿化

事实上，如何将污泥中夹带的金属硫化物沉淀分离出来，是厌氧SRB 工艺能够稳定运行的关键，是采用生物法处理各类含硫酸盐重金属废水的环保工作者都会面临的难题。值得关注的是，自然界中SRB诱导的生物矿化现象给了人们重要启示。

3.1 SRB介导的生物矿化成矿

生物矿化是指生物介入的无机矿物形成过程，其实质是生物影响下进行的晶体生长过程。美国科学家Banfield课题组首次在矿坑内的生物膜中发现了SRB生物矿化形成的闪锌矿矿物聚集体（见图1），扫描电子显微镜和能量色散X 射线分析表明，该聚集体由直径为2～5nm 的闪锌矿晶体组成，揭示在高浓度重金属离子的矿山环境中，在局部缺氧条件下SRB可以通过生物的诱导矿化作用固定矿化重金属。在此基础上，García 等利用从某黄铁矿带尾矿池底部采集的SRB混合种群，对该尾矿堆置场排放的污染液进行处理，结果表明在pH＞4.0时，SRB 在含有9000mg/L SO、30mg/L Fe(Ⅱ)和100mg/L Cu(Ⅱ)的环境中生长9 天后，SO去除率达85%，Fe和Cu去除率几乎达到100%，并发现纳米级FeS和CuS形式矿物。这些研究表明，SRB生物成因的金属硫化物矿物具有一定的形貌和结构，但颗粒粒径一般很小，为纳米级。显然，这种纳米级金属硫化物矿物颗粒还难以与污泥分离。刘牡丹等研究表明，当污泥中硫化矿的颗粒达到微米级可采用物理方法进行分选回收。而微米级矿物需由大量随机取向的、纳米直径的矿物聚集而成，因此如何促使金属硫化物沉淀聚集生长形成微米级矿物是目前研究者需要解决的关键问题。

图1 SRB细胞壁上纳米矿物团聚体[44]

还有研究表明，生物矿化过程实质是在生物的特定部位，在一定的环境条件下，在生物产生的有机物质的控制和影响下，将溶液中的离子核化、沉淀和相变为固相矿物的过程。大量生物地质学和矿物学方面的研究表明，SRB在各种形式矿床中参与了成矿过程，SRB在草莓状黄铁矿形成过程中不仅是黄铁矿前体硫铁矿的硫源，而且影响整个形成过程中黄铁矿的成核速度。Lin等对南海北部天然气水合物赋存区沉积物中自生矿物特征的研究，发现在SRB 及其共存微生物的活动下，可产生大量的黄铁矿莓球（平均粒径＞20μm，标准偏差＞3.0μm）和单质硫颗粒（粒径10～20μm），且黄铁矿与单质硫颗粒共存呈“离群”的粒径特征，见图2。最近还有文献表明，将钻孔盐沼地下几米深处获得的磷石膏接种至富含重金属（Fe，Zn，Cu，Cd）的培养基中，分别以马粪、豆类植物堆肥发酵等有机酸组分作为碳源，也矿化形成了草莓状黄铁矿、多面体黄铁矿、草莓状黄铜矿和方铅矿，其莓球及多面体的粒径在10～20μm范围，见图3。

图2 天然气水合物赋存区沉积物中自生矿物的SEM图

图3 实验培养基中反应产物的SEM图[55]

3.2 SRB生物矿化成矿影响因素

对于处理AMD 的硫酸盐还原厌氧体系，SRB分泌的EPS、体系中的离子强度及pH 是诱导金属硫化物矿化成矿的重要因素，并影响矿化产物物相、形貌、结构及其元素组成。

3.2.1 胞外聚合物

在AMD 处理的硫酸盐还原体系中，污泥是核心，是SRB 及其他共存微生物的载体，也是微生物矿化重金属形成矿物的载体。污泥被微生物分泌的EPS包裹，其通常含有多糖、蛋白质、核酸、腐殖酸和脂类等聚合物分子。研究表明，EPS易于形成胶体网络从而能够将微生物保留在污泥中，缓冲生态环境对微生物的冲击和毒性（如pH、盐度、重金属离子）。另有文献指出，载有微生物的污泥分泌的EPS比纯培养的细菌分泌的EPS量更多且能更好地络合重金属。

Banfield等发现微生物代谢产生的EPS可以在很大程度上影响金属硫化物的尺寸、形貌和结构。Gadd的研究结果表明微生物分泌的EPS与其介导的矿物形成有关。最近，Do等从.LRP3中提取EPS，通过生物矿化诱导形成Cu(PO)(OH)晶体；Xing 等利用腐殖酸使菱铁矿转变为针铁矿，矿物粒径为5～20μm。本文作者课题组利用ABR 处理硫酸盐有机废水长期运行，颗粒污泥中优势SRB 为属，颗粒污泥表面有草莓状黄铁矿形成，黄铁矿莓球呈现“离群”的粒径特征，莓球粒径约20μm，组成莓球粒的多面体微晶粒径约2.0μm。此外，颗粒污泥表面的单质硫（S）颗粒被大量EPS 包覆，并且形成矿物和单质硫颗粒的颗粒污泥中的EPS组分和官能团与未形成矿物的明显不同。

由此推测，微生物分泌的EPS在微生物矿化成矿过程中起决定性的作用，与矿物形成过程的结晶、相变和尺寸大小相关；同样地，SRB 分泌的EPS 是联系SRB 与金属硫化物的纽带，SRB-EPS-金属硫化物三者相互作用诱导形成了硫化矿，同时这三者间相互作用的关键影响因子是环境液相介质组分和环境条件。

3.2.2 离子强度

环境中离子强度会影响金属硫化物的成核率，进而影响金属硫化物的团聚与最终形态。离子强度的不同会导致SRB 代谢作用下缺氧终产物的不同，从而影响矿化产物的物相。张鑫通过模拟膏盐层不同离子强度，研究SRB 在不同离子强度下的代谢情况及其对晶体产物的影响，发现高离子强度会对SRB 的生长代谢活性产生抑制作用，进而对晶体沉淀产生抑制作用。田琳奇研究发现高离子强度促进了CdS的形成，使CdS成核率增加，形成了更多的CdS晶体，且高离子强度能够增大其晶体高度。Mullaugh 等通过实验探究不同离子强度下CdS的团聚时发现，高离子强度能够成倍地增加CdS粒子的粒径及促进CdS的团聚。

3.2.3 pH

在SRB法处理AMD过程中，pH会影响其中的金属离子强度，从而导致SRB 硫酸盐还原体系中金属硫化物的矿化速率不一样。Liu 等研究发现不同初始pH 条件下硫化物的晶体生长方式无明显差异，都有从无定形态向晶态转化的过程，但是会影响晶体数量和高度；在低pH 条件下，SRB 生长迟滞进而硫酸盐还原速率降低，从而导致较低的金属硫化物晶体数量与高度。董净等研究SRB法处理重金属废水并分析矿化产物特性时发现，在SRB 钝化金属离子的过程中液相pH 不断升高，有利于诱导合成金属硫化物晶体。Warthmann 等发现在SRB 诱导矿化的实验体系中，溶液pH 的改变能影响硫酸盐矿物生成速率，并最终影响矿物种类和形貌特征。

3.3 SRB参与的生物矿化过程微观机理

微生物通常以生物诱导矿化（biologically induced mineralization，BIM） 和 生 物 控 制 矿 化（biologically controlled mineralization，BCM） 两种方式参与矿物的形成过程，应用于重金属污染治理的矿化技术以BIM 为主。BIM 是被动矿化的过程，微生物的代谢产物影响胞外微环境的理化性质，并在局部环境中形成过饱和状态，促进重金属离子形成沉淀，进而影响生物诱导矿化过程。

根据文献资料，SRB 具有聚积溶液中低浓度SO的能力，SO首先在细胞外积累，然后通过SRB细胞膜进入细胞内。在SRB细胞内，还原硫酸盐包括分解、电子传递和氧化三个阶段：首先在分解阶段，有机物在厌氧条件下被分解为乙酸、CO等，并产生少量的ATP；电子传递阶段是分解阶段产生的高能电子通过SRB 特有的电子传递链（如黄素蛋白、细胞色素C等）逐级传递，同时产生大量的ATP；在氧化阶段，电子被传递给SO，并将其还原为S，同时消耗大量的ATP，此阶段还包括SO激活、腺苷酰硫酸（APS）还原、SO还原等中间过程。在SRB 细胞内还原SO产生的S和其他代谢产物通过细胞膜被排出体外，进入周围环境。对于SRB 细胞内还原SO生成S的机理已经有相当深入的研究，但是，在体外S与重金属生成的硫化物沉淀是如何诱导矿化形成矿物的呢？该过程的微观机理尚未见详细报道。

曾有文献报道，SRB通过提供生物膜来促进生物矿化过程的发生，能够在其细胞表面发生成核作用，从而促进自然环境中金属硫化物晶体的形成。最近，Duverger 等通过透射电子显微镜观察发现，在SRB细胞外的EPS中可聚集直径达几百纳米的黄铁矿球粒。Berg等在SRB生物矿化实验中，观察到草莓状黄铁矿与细胞外的腐殖质、DNA等有机物结合在一起，推测这些有机物可能为黄铁矿的沉淀提供了吸附成核位点。Bontognali 等和Kenward 等进一步研究SRB 细胞表面及EPS 的官能团对生物矿化成矿的影响，发现带有诸多呈电负性的官能团（如羧基、磷酰基、羟基等）能够吸附金属阳离子，同时为矿物的形成提供成核位点和早期生长模板。黄亚蓉的实验结果也表明，SRB裸细胞和EPS上高浓度高密度的羧基和磷酰基基团可促进无序矿物矿化。

此外，Aloisi 等和Bontognali 等在硫酸盐还原菌和进行矿化实验中发现，矿物沉淀主要是在菌体附近的胞外聚合物球粒上进行的，而非直接发生在细胞壁上，避免细胞表面的矿物沉淀。由此提出，微生物在调控矿物生成的过程具有一种自我保护机制，以避免在细胞表面出现不可控的矿物沉淀所引起的包埋，同时通过调控矿物的形成降低细胞周围溶液中的金属离子浓度，减少这些金属离子对细胞的毒害作用，为微生物提供更为有利的生存环境。

综上所述，本文作者推测SRB 参与的生物矿化过程如下：①SRB表面及EPS带有诸多呈电负性的官能团，吸附并聚集周围溶液中重金属离子（Me）于细胞表面或部分进入细胞体内；②SRB通过细胞膜聚集废水中SO并进入体内，在细胞内还原SO生成S，少部分S在体内与进入细胞内的Me结合生成MeS沉淀后排除体外，大部分S排出体外与细胞表面的Me 结合生成MeS 沉淀；③MeS沉淀在EPS及细胞表面官能团的作用下，通过结晶、成核形成微小的纳米矿化产物，进而聚合在一起形成大颗粒的矿物，见图4。

图4 SRB诱导金属硫化物矿物形成过程示意图

然而，由于缺乏SRB 诱导沉淀颗粒物矿化成矿的直接观察证据，无法深入了解SRB 在矿化过程所发挥的具体调控机制，该方向仍需进一步研究。

4 结语与展望

在目前SRB 法处理AMD 过程中，一方面由于各种金属硫化物和起始沉淀pH不同造成各类金属离子沉淀不稳定，另一方面厌氧过程中金属沉淀夹带污泥不易分离，往往导致厌氧反应器运行失败，从而制约了SRB 法在AMD 治理中的工程化应用。虽然国内外实验研究中取得了一些进展，然而，在硫酸盐还原体系中，如何调控金属硫化物沉淀形成可与污泥分离的矿物需要进一步探索，其中的生物矿化成矿机理更需要深入研究。因此，今后需要重点关注的研究内容有：①研发多相分离硫酸盐还原体系处理AMD 废水，通过调控体系运行参数和内部环境，实现最大程度地将AMD 中多种重金属转变为硫化物矿物，获得硫酸盐还原体系成矿的技术参数；②利用同位素、K边X射线吸收近边结构（K 边-XANES）、原子力显微镜（AFM）、透射电子显微镜-电子选区衍射（TEM-SAED）和高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）等先进技术，深入研究硫酸盐还原体系污泥中金属硫化物结晶、成矿的物相演变过程；③利用现代分子生物学手段，深入分析硫酸盐还原体系污泥中金属硫化物结晶、成矿的微生物群落演替及功能菌群交互作用规律；④综合利用环境科学、生物地质学和地质矿物学的研究思路和研究方法，以硫酸盐还原厌氧污泥为研究核心，探究SRB、EPS、金属硫化物、液相介质之间的交互作用关系，从深层次挖掘重金属微生物固定与矿化的微观过程及其调控因素，揭示硫酸盐还原体系矿化固定AMD中重金属成矿的机制。