精子形态学染色的现状及发明专利的设计方案

史卿菁，胡玉清，汤姣，黄园，孙大林，丁旭锋*

（1.宜兴市妇幼保健院生殖健康科，江苏 无锡 214200；2.宜兴市妇幼保健院检验科，江苏 无锡 214200；3.东南大学附属中大医院中西医结合男科，江苏 南京 210029）

0 引言

随着国家生育政策的调整，男性不育症成为社会关注的问题，需要进一步重视男性的生殖健康保健和检查治疗[1]，男性生育能力主要通过对精子的检测来评价，主要的指标为精液量、精子浓度、精子活力、精子形态学检查以及精子碎片指数等[2]。其中精子形态学检查即精子畸形率检查，可以有效评估精子使卵细胞受孕的能力[3]。有研究认为精子畸形率过高可以使配偶胚胎丢失，与女方的复发性流产相关[4-5]。依据2021年最新的《世界卫生组织人类精液检查与处理的实验室手册》第六版[6]的要求，检查精子的形态需要进行精子涂片后染色再进行检测，仔细观察精子的形态结构，稍有不足即为异常。精子形态学检查的染色和普通病理学诊断的染色要求不完全一致，精子形态学检查的染色对染色时间和染色深浅度要求较高。

1 精子染色的现状

1.1 染色试剂

精子染色的方法有多种，目前常用的染色方法有三种，分别是Shorr染色、巴氏染色、Diff-Quik染色法[7]。染色需要用固定液及染色剂等2种以上的化学试剂，临床较常用的Diff-Quik染色法需要依次使用三种化学试剂，分别是固定液、染色剂A、染色剂B，三种试剂按顺序与涂有精子的玻璃片进行接触，玻璃片在接触后一种试剂的时候，要尽量减少前一种试剂的残留，但是不能用纸或布擦拭，目前一般采用蒸馏水冲洗后风干，每一种试剂接触精子玻片时间的长短会影响到精子染色的深浅，而染色的深浅会影响精子形态学的诊断结果，即影响精子畸形率。精子玻片的染色效果不光与染色剂持续的时间相关，与染色试剂纯度也相关，与染色剂的温度也有关，因此，染色的环境温度、染色剂的纯度、染色时间都应该标准化[8]。

1.2 常用的染色方式

目前使用的各种染色方法主要通过两种基本的染色方式，即滴染和浸染。滴染的主要步骤是几种染色试剂按时间依次滴于玻璃片表面，这种染色方式的优点主要是不同试剂之间不易导致混和，试剂的纯度有保证。浸染的主要步骤是把玻璃片按顺序浸到几种染色试剂里，这种方式分为手工和自动，其优点是玻璃片接触试剂的时间可以严格统一，特别是采用自动化设备开展的成批量浸染。目前只有少量的大型医疗机构采用节省人力的自动化精子染色。对于临床检验，采用快速、精准、简单标准化的染色技术对精子形态学检查有重要意义[9-10]。

1.3 目前染色技术的弊端

据研究统计[11]目前精子形态学检查前的精子处理方式不统一，精子的洗涤、涂片、染色、以及进行精子形态学诊断的检验人员较难标准化，对精子畸形率检测结果影响较大，其中精子的染色过程标准化是一个难点，据陆金春综述分析[12]精子染色的方法、染色的时间不一致，对精子形态学的检测结果影响很大。目前临床使用滴染的缺点为纯手工进行，染色过程中每一步骤的时间不统一，对于标本数量较多的单位，该种方式很不方便，也容易导致试剂的浪费。浸染最大弊端是玻璃片接触前一种试剂后可将附着的试剂带到后一种试剂内，后一种试剂的纯度易改变，一组试剂数次使用后，试剂纯度的改变容易影响染色的效果，经常更换试剂也是较大的浪费。临床多数医疗机构精液检查的样本量相对较小，较难采用全自动化的精子染色方法。

2 发明专利的设计

2.1 设计目的

本发明专利根据目前临床精子染色过程中的不足，设计了一种构造比较简单，制造成本较低，操作过程比较方便的装置，可有效杜绝不同试剂之间的混合，以实现精子染色及形态学诊断全过程的标准化。

2.2 发明专利

发明专利名称：半自动精子染色仪。专利号：ZL 2015 1 0687294.4 申请时间：2015年10月22日，发明专利授权公告时间：2018年2月13日。第一发明人：丁旭锋。专利权人：宜兴市妇幼保健院。

2.3 专利的主要创新

本发明专利创新性的使用压染的方式，和以往的染色方式有明显的不一样，并设计有专门的时间控制仪，控制染色过程中的每一步程序的时间，有效地避免了试剂容易出现混和的弊端，在常规的室温的情况下可以统一精子染色的每一步程序，有助于统一精子形态学诊断的标准。为以后人工智能技术用于精子形态学诊断提供了可行性。

2.4 发明技术方案

（1）本装置主要包括长方体的基座，基座中沿长边并列排布有若干条可以存放少量染色试剂的小容器，以及位于基座上方的一组手工压染装置，压染装置主要是指与基座短边相平行的压板，以及压板上设置有可装卸的若干个涂覆有精子的玻璃片，压板的两端设计滑动连接装置，可以使压板能灵活上下翻转，并且可以沿基座的长边往返滑动。

（2）存放染色试剂的容器主要包括可拆卸的长方体基体以及镶嵌在基体上的多个柔性碗状存放染色试剂的容器，所述容器用弹性塑胶制成，在外力作用下可以轻度变形。

（3）压板中固定的涂覆有精子的玻璃片与碗状存放染色试剂容器的位置对应，翻转压板玻璃片可以接触到碗状存液容器中的液体。

（4）压板的长边设置有柱状压杆，压杆两端突出为把手，染色时双手握住两侧把手。

（5）压杆上对应于玻璃片的方向设计了出水口和出风口，出水口和出风口通过柔性管道连接基座的供水及送风系统，以便冲洗及风干。

（6）基座的长边上设计有时间显示器，压杆的把手附近设计时间显示器的按键，控制及计算时间。

2.5 附图说明

图1为本发明的结构示意图。

图1

图中标记简介如下：1是长方体的染色仪基座。2是设置于基座上沿长边并列排列的可拆卸的3条存放染色试剂容器条。3是设置于基座上方的可以翻转压染装置；3.1是长边与基座短边水平的压板；3.1.1是数块涂覆有精子的玻璃片，固定在压板3.1上。4是滑动连接装置，位于压板3.1的长边两端，滑动装置可以使压板上下翻转也可以沿基座的长边往复滑动。2.1是与基座1固接的条状可拆卸的基体；2.2是设置在条状的基体上的数个弹性碗状存液容器，与涂覆有精子的玻璃片3.1.1位置相互对应。5是导轨槽，所述滑动连接装置4镶嵌于导轨槽5内，可以沿导轨槽5前后滑动。6是压杆，位于压板3.1的长边上；6.1是把手，位于压杆6的两端延长部分；6.2是出风口，6.3是出水口位于压杆6上；出风及出水方向对应玻片方向，每一块玻片均有出风口和出水口。7是时间提示器，位于基座1上。8是计时器按钮位于压杆6上。

3 发明专利的使用过程描述

精液在恒温水浴箱中液化后采用精液分析仪检测精子浓度及活力，剩余的精液标本进行精子形态学检查，精子染色前，需要对精液进行洗涤和稀释，根据精子的浓度规范精液洗涤和稀释的具体方案，使洗涤后稀释的精液的浓度基本一致，取固定量的稀释后的精液进行涂片，涂片干燥后的精子玻片放置在本案设计的半自动精子染色仪上进行染色，一般是5～6张玻片同时进行染色。具体操作如下：将玻片固定于3.1.1处，将压板3.1压于对应于的2.2碗状存液器（事先在存液器中加液0.1～0.2mL）,玻片接触试剂固定时间后时间提示器7会自动提示，手工提起压板3.1，玻片上的液体会自动往下流，出风口6.2会自动出风吹走液体，出水口6.3会有少量出水进行冲洗玻片，再风干，完成第一排液体的接触后，按同样的方式接触第二排液体，接触第三排液体。在染色过程中，固定剂或染色剂均保证了同样的浓度，无混合。玻片接触固定剂或染色剂的时间以及冲水风干的时间均实现了标准化。染色完成后取下玻璃片进一步干燥后待检测。将染色液容器条2取下进行充分清洗干净备用，在实践过程中可以准备多个容器条2，使用完毕后一起清洗，晾干。本专利设备适合每天精子形态学检查标本量5～30例左右的中小型医疗机构。

4 总结

精子形态学诊断是评估男性生育能力的重要途径，目前多数医疗机构特别是广大的基层医疗机构因为每天的标本量较少，无法采用全自动的染色设备，手工的滴染或浸染较难实现精子染色的标准化，本发明专利采用半自动方式，设备成本很低，体积较小，创新地采用压染的方式，对染色的每一步骤都可以进行标准化，使用方便，有效地解决了目前手工染色过程中相关不足，便于精子形态学检查的标准化质量控制，也为未来人工智能自动化阅片提供了保障[13]。