60Co-γ辐照模式下玉米中赤霉烯酮和品质的变化及对绵羊定时人工授精的影响

李心海 朱广琴 高 峰 张林吉 任士飞 王 岩 崔 燕

(1 甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；2 徐州生物工程职业技术学院，江苏 徐州 221151；3 江苏汉羊牧业生态科技有限公司，江苏 徐州 221151)

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)又称F-2毒素，该霉菌毒素常见于玉米等谷物中。在高温多雨的夏秋季节，谷物和饲料易受潮而产生霉变[1-2]。杜妮[3]研究发现，99.5%的谷物及饲料中含有两种及两种以上的霉菌毒素，其中ZEN的污染最为常见。周建川等[4]研究发现，从全国采集到的1 034份目标饲料样品中，ZEN检出率超80%，且其中28.89%的玉米ZEN含量超标。

ZEN会对人类及各种畜禽产生生殖毒性、遗传毒性，并对其健康造成严重影响[5]。周敏等[6]用含有1.5 mg·kg-1ZEN的饲料饲喂35日龄小母猪，结果表明，ZEN导致小母猪子宫内膜增生、坏死、腺体萎缩。刘秀凤[7]和Shi等[8]研究发现，ZEN能够导致卵巢病变，从而影响动物的正常排卵，甚至干扰动物发情，不仅会降低胎仔数，还有可能导致假孕和子宫内膜增生等，进而降低受孕率。因此，降低谷物、饲料、食品中ZEN的含量以减少ZEN对人畜的危害势在必行。目前常用的去除ZEN的技术方法有射线辐照、臭氧处理、添加吸附剂、生物降解等[9]。60Co-γ辐照技术是近几十年出现的一种冷处理技术，具有高效经济、环保实用、安全便捷的优势。研究表明，60Co-γ辐照技术能够有效降解ZEN、红青霉毒素、赭曲霉毒素等[10]。经60Co-γ辐照后，玉米中的ZEN可得到有效降解[1]，且玉米营养成分无明显损失[11]。

以往的研究主要是对经60Co-γ辐照后的稻米、小麦等谷物的ZEN降解率及其品质结构变化进行分析[1，6]，而关于60Co-γ辐照后玉米中ZEN降解效果和品质结构变化对定时人工授精中种公羊和母羊生殖性能影响的研究极少。基于此，本研究通过检测不同剂量60Co-γ下受ZEN自然污染玉米中ZEN的降解率、主要营养成分和淀粉的微观结构变化情况；并将10 kGy60Co-γ辐照后的玉米饲喂定时人工授精的绵羊，检测绵羊种公羊射精量、精液品质及母绵羊同期发情率、受孕率、死胎率、产羔率、胎儿体质等多方面变化，以期为自然污染ZEN的玉米经60Co-γ辐照后作为饲料正常饲喂繁育绵羊提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米籽粒(含ZEN)，购自江苏徐州大华种业有限公司；ZEN标品，购自德国Sigma公司；乙腈、乙酸、甲醇，均为色谱纯，购自上海科旺试剂公司；氯仿(分析纯)，购自天津市精强化工公司；氮气、氧气，购自徐州特种气体公司。

澳洲白种公羊(体重约70 kg、2～4岁)、湖羊母羊(体重50～60 kg、2～3岁)，购自江苏汉羊牧业生态科技有限公司；60Co-γ射线源，江苏连云港辐照中心。

1.2 试验设计

1.2.1 玉米的选取 称取玉米粒样品15份，每份样品1 000 g，用自封袋封装，置于60Co-γ辐照中心辐照，平均剂量率为0.31 Gy·s-1。按照国际原子能机构规定的小于10 kGy剂量为安全剂量的标准[12]，设定0、3、5、8、10 kGy 5个辐照剂量，每个剂量设3次重复。辐照后的玉米用于玉米中ZEN的检测、玉米断面的观察及营养成分测定。

1.2.260Co-γ辐照式下玉米对澳洲白种公羊、湖羊母羊定时人工授精中的影响

1.2.2.1 澳洲白种公羊试验设计 将15只体重约70 kg，2～4岁的澳洲白种公羊随机分成3组，每组5只。试验于2020年9月—11月在江苏汉羊牧业生态科技有限公司进行，试验设计30 d，按表1饲料进行分组饲喂。每只羊每隔2 d进行1次日常采精，对试验第1、第15和第30天采集到的精液进行ZEN含量检测。

圈舍实行分栏饲养，羊圈统一用丙硫咪唑驱虫与常规免疫，用新洁尔灭消毒液对地面、墙壁、房顶、羊栏进行全消毒，房舍进行通风，保持采光良好。种公羊饲料按养殖场常用配方将饲料原料制成颗粒料，其中玉米占比20%。每天早晨8点和下午5点分两次投喂饲料，自由采食，自由饮水。

1.2.2.2 湖羊母羊试验设计 于2020年9月—2021年3月，选取90只体重约60 kg，2～3岁的经产湖羊母羊，随机分为3组，按表1饲料进行分组饲喂。选择养殖场正常养殖使用的湖羊种公羊精液授精。

表1 各组绵羊饲料ZEN含量

1.3 试验方法

1.3.1 玉米中ZEN的检测 ZEN检测参照《GB/T 23504-2009食品中玉米赤酶烯酮的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法》[13]。用LC600A高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)仪(南京科捷仪器公司)对ZEN进行定量分析，用MultiSep 226净化柱(天津迪马科技公司)对ZEN分离纯化的固相进行萃取。按照以下公式计算ZEN降解率：

ZEN降解率=(辐照前样品中ZEN量-辐照后样品中ZEN量)/辐照前样品中ZEN量×100%

(1)。

1.3.2 玉米断面的观察及营养成分测定 玉米断面的观察：横向掰开玉米粒，使其呈自然断面，并保持断面平整，用吸耳球吹除断面上的微细粉粒。使用KAS-2000F离子溅射仪(英国布莱特公司)对玉米断面喷金，以增强玉米断面的导电性，通过扫描电镜放大 6 000 倍观察玉米淀粉的结构。

玉米营养成分测定：委托徐州市畜牧兽医站实验中心进行检测。玉米养分评价指标主要包括粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、粗淀粉和粗灰分。粗蛋白(crude protein, CP)含量采用《GB/T 6432-1994饲料中粗蛋白测定方法》[14]的方法进行测定，粗纤维(crude fibre, CF)含量采用FOSS全自动纤维分析仪(丹麦福斯公司)测定[11]，粗脂肪(ether extract, EE)含量采用《GB/T 6433-2006饲料中粗脂肪的测定》[15]的方法进行测定，粗灰分(crude ash, ASH)含量采用《GB/T 6438-2007饲料中粗灰分的测定》[16]的方法进行测定，样品重复3次以上。

1.3.3 精液品质分析 精液品质分析指标主要包括采精量、精子活力、精子密度和精子畸形率。精液采集：将5 μL精液滴加于洁净载玻片上，显微镜下观察并采集合格的精液，用集精杯(标有刻度)收集精液并读取精液量。将每只羊的精液平均分为2份，用大豆卵磷脂BioXcell和含卵黄Optidyl分作两部分冷冻保存。精子活力检测：参照《DB15/T 1769-2019马、驴冷冻精液制作操作规程》[17]标准进行，取出冷冻后的精子，在37℃水中放置30 s。取5 μL精液滴加于Leja玻片腔室中，用IVOSⅡ精子分析仪(美国Hamilton Thorne公司)分析其活力情况。精子DNA完整性分析：利用精子顶体染色试剂盒PSA-FITC进行DNA完整性分析。

1.3.4 母羊定时人工授精分析 母羊定时人工授精分析指标包括同期发情率和受胎率。发情状况主要根据母羊外阴部和母羊精神状态来断定。配种后50 d，用B型超声波仪(广州索诺星信息科技有限公司)妊娠诊断，统计受胎数。按公式(2)计算同期发情率；按公式(3)计算受胎率：

同期发情率=每组发情羊数/每组羊总数×100%

(2)

受胎率=每组怀孕羊数/每组羊总数×100%

(3)。

1.3.5 湖羊母羊产羔情况和羔羊初生始重分析 湖羊母羊产羔情况和羔羊初生始重指标包括产羔总数、死胎数、产羔率、羔羊成活率和羔羊始重。母羊分娩时，根据实际情况记录产羔情况，称取初生羔羊体重，并按公式(4)、(5)计算产羔率、羔羊成活率：

产羔率=出生羔羊数/分娩母羊数×100%

(4)

羔羊成活率=出生时活羔羊数/出生羔羊数×100%

(5)。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2010软件记录试验数据，并对数据进行整理、计算、对比、绘图。用SPSS 17.0统计软件进行方差分析，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同60Co-γ射线辐照条件下玉米中ZEN含量变化情况

由表2可知，未经60Co-γ辐照的玉米中ZEN含量为2 153 μg·kg-1，超过《GB 13078.2-2006饲料卫生标准》[18]对谷物、饲料中ZEN的限定标准(≤ 500 μg·kg-1)。随着60Co-γ辐照剂量的增加，玉米中ZEN降解率逐渐增大，但在8～10 kGy剂量下，玉米中ZEN降解率增速低于0～8 kGy剂量处理。在8 kGy剂量下，玉米中67.2%的ZEN被将解，含量降至706 μg·kg-1，超过国家对谷物、饲料中ZEN的限定标准(≤500 μg·kg-1)。在10 kGy剂量下，玉米中83.7%的ZEN被降解，含量降至351 μg·kg-1，符合国家对谷物、饲料中ZEN的限定标准(≤500 μg·kg-1)。

表2 不同60Co-γ射线辐照条件下玉米中ZEN含量变化

2.2 60Co-γ射线处理对玉米淀粉颗粒的影响

将60Co-γ辐照过的玉米淀粉用JSM-6700F冷场发射扫描电子显微镜(日本电子株式会社)放大6 000倍观察(图1)，可见60Co-γ射线辐照处理的玉米淀粉颗粒表面光滑，无凸凹不平及孔洞出现；3 kGy60Co-γ射线辐照处理后，个别淀粉颗粒破裂；5 kGy60Co-γ射线辐照处理后，少量淀粉颗粒破裂；8 kGy60Co-γ射线辐照处理后，破裂淀粉颗粒增多；10 kGy60Co-γ射线辐照处理破裂的淀粉颗粒明显增多。由此可见，60Co-γ辐照未破坏玉米淀粉颗粒表面形态，但破坏了玉米淀粉颗粒的完整性。

图1 电子显微镜放大6 000倍下不同60Co-γ辐照剂量处理的玉米淀粉颗粒

2.3 60Co-γ辐照对玉米营养成分的影响

由表3可知，0～10 kGy60Co-γ辐照处理后，玉米粗蛋白含量为6.85%～6.94%，最大相差0.09个百分点。随着辐照剂量的增加，玉米中水分含量呈逐渐降低趋势，最高含量(14.10%)比最低含量(13.80%)高0.03个百分点，差异不显著(P>0.05)；粗脂肪含量呈逐渐升高趋势，最高含量(0.28%)比最低含量(0.27%)高0.01个百分点，差异不显著(P>0.05)；粗纤维最高含量(0.45%)比最低含量(0.43%)高0.02个百分点，差异不显著(P>0.05)；粗灰分含量最高为0.12%，最低为0.11%，差异不显著(P>0.05)。综上，0～10 kGy剂量60Co-γ辐照处理，对玉米粗蛋白、水分、粗淀粉、粗脂肪、粗纤维和粗灰分含量均无显著影响。

表3 60CO-γ辐照处理后玉米主要营养成分

2.4 60Co-γ辐照模式下含有ZEN的玉米对澳洲白种公羊在定时人工授精中的影响

由表4可知，Ⅰ对照组与试验Ⅱ组的种公羊在第30天时的采精量、精子活力、精子密度均无显著差异(P>0.05)。试验Ⅲ组种公羊在第30天时的采精量、精子密度、精子活力与试验Ⅱ组、对照组相比显著下降(P<0.05)；而精子畸形率与试验Ⅱ组、Ⅰ对照组相比明显升高。显微镜下观察绵羊种公羊精子，有双尾精子、精子聚集、精子头部尾部不完整、双头精子、无尾精子等现象。以上数据表明，自然污染ZEN含量为 2 153 μg·kg-1的玉米，经10 kGy60Co-γ辐照后，符合《GB 13078.2-2006饲料卫生标准》[18]，可以作为饲料饲喂种公羊，对绵羊种公羊采精量、精子畸形率、精子活力、精子密度不产生显著影响(P>0.05)。

表4 澳洲白种公羊精液品质检测

2.5 60Co-γ辐照模式下含有ZEN的玉米对湖羊母羊定时人工授精的影响

2.5.1 饲喂经60Co-γ辐照含有ZEN的玉米对湖羊母羊同期发情率和受胎率的影响 由表5可知，Ⅰ对照组、试验Ⅱ组母湖羊的同期发情率分别比试验Ⅲ组显著提高16.71、15.96个百分点(P<0.05)；受胎率分别比试验Ⅲ组显著提高20.72、16.97个百分点(P<0.05)。Ⅰ对照组母湖羊的同期发情率、受胎率与试验Ⅱ组无显著差异(P>0.05)。

表5 湖羊母羊同期发情率和受胎率

2.5.2 饲喂经60Co-γ辐照含有ZEN的玉米对湖羊母羊产羔情况和羔羊始重的影响 由表6可知，试验Ⅱ组的产羔总数、产羔率、羔羊成活率、羔羊始重与Ⅰ对照组无显著差异(P>0.05)，说明对湖羊母羊饲喂经10 kGy60Co-γ辐照后含144 μg·kg-1ZEN的玉米(表1)，对湖羊产羔及羔羊始重影响不显著(P>0.05)。试验Ⅲ组产羔总数比Ⅰ对照组、试验Ⅱ组分别少22、20只(P<0.05)；产羔率比试验Ⅱ组、Ⅰ对照组分别显著降低31、32个百分点(P<0.05)；羔羊成活率比试验Ⅱ组、Ⅰ对照组分别显著降低9.8、11.2个百分点(P<0.05)；羔羊始重与试验Ⅱ组、Ⅰ对照组相比分别显著降低0.55、0.57 kg(P<0.05)。说明对母湖羊饲喂未经10 kGy60Co-γ辐照的自然污染ZEN的玉米，能够显著降低湖羊产羔总数、产羔率、羔羊成活率和羔羊始重。

表6 湖羊母羊产羔情况和羔羊初生重结果

3 讨论

3.1 60Co-γ射线辐照后玉米ZEN含量变化

本研究结果显示，在8～10 kGy剂量下，对试验II组玉米进行降解处理，ZEN降解率增速低于0～8 kGy剂量降解率增速，可能是由于玉米粒表面的ZEN被降解，而玉米粒内部的ZEN降解难度增大[19]，这与郭东权等[20]的研究结果基本一致。由此推断，当玉米中ZEN降解率为67.2%时，玉米中的自由基减少，ZEN与自由基反应的几率下降。因此，8～10 kGy剂量下玉米中ZEN降解率增速降低。

本研究中，未经60Co-γ辐照的无污染的玉米中ZEN含量为2 153 μg·kg-1，在8 kGy剂量下，ZEN含量降至706 μg·kg-1(降解率67.2%)，超国家标准；在10 kGy剂量下，ZEN含量降至351 μg·kg-1(降解率83.7%)，这与尹青岗[21]的研究结果基本一致。说明ZEN含量不超过2 153 μg·kg-1的玉米经过10 kGy剂量60Co-γ辐照后，玉米中的ZEN被有效降解，符合国家标准，可以用作饲料。

3.1.160Co-γ射线辐照处理对玉米淀粉颗粒的影响 本研究电镜观察结果显示，10 kGy60Co-γ辐照未破坏玉米淀粉颗粒表面形态，但会破坏玉米淀粉颗粒的完整性。可能是由于在辐照作用下，淀粉分子链被打开，断链部位失去电子，生成带电活性物质，具有较强的生物活性，能够与周围物质发生物化反应，生成共聚物，进而改变了淀粉的内部结构，破坏淀粉颗粒的完整性。

3.1.260Co-γ辐照对玉米营养成分的影响 本研究发现，随着60Co-γ辐照剂量的增加，玉米中粗脂肪含量增多。经0、3、5、8、10 kGy60Co-γ辐照处理后玉米的粗蛋白、水分、粗淀粉、粗脂肪、粗纤维和粗灰分含量无显著差异(P>0.05)，即低剂量60Co-γ辐照对玉米营养成分无显著影响。与崔龙等[22]、徐远芳等[23]、罗莉[24]的研究结果基本一致。

3.2 不同试验组的效果和机制

3.2.160Co-γ辐照模式下含有ZEN的玉米对澳洲白种公羊在定时人工授精中的影响 ZEN生殖毒性较强，可导致雄性老鼠生殖能力损伤，并通过多种作用机制导致精液品质下降[25]。本研究发现，对试验Ⅲ组饲喂自然污染ZEN含量为2 153 μg·kg-1的玉米，试验Ⅲ组澳洲白种公羊的采精量、精子活力、精子密度与试验Ⅱ组、Ⅰ对照组相比显著下降，精子畸形率显著上升。逄健等[26]对小鼠饲喂ZEN，发现ZEN使雄性小鼠睾丸体积、质量显著下降，精子活力、射精量显著减少，生殖能力下降。这与本次研究结果一致。董双等[25]对雄性小鼠注射ZEN，发现ZEN破坏睾丸细胞，降低了睾酮合成，减少了精液生成。本研究也证实了动物摄入ZEN能导致其精液生成减少。

本研究发现，试验Ⅱ组与Ⅰ对照组澳洲白种公羊的采精量、精子畸形率、精子活力、精子密度均无显著差异(P>0.05)，说明ZEN含量为2 153 μg·kg-1的玉米经过10 kGy剂量60Co-γ辐照后，对澳洲白种公羊生殖性能无显著影响。而对其饲喂ZEN含量为2 153 μg·kg-1的玉米后，精子品质显著降低。因此10 kGy剂量辐照后的玉米，可以正常饲喂澳洲白种公羊。

3.2.260Co-γ辐照模式下含有ZEN的玉米对湖羊母羊定时人工授精的影响 ZEN与雌二醇结构相似[27-30]，会使子宫内膜卵母细胞发育成熟过程受到阻碍，颗粒细胞增生速度减缓[31-32]。本研究发现，试验Ⅰ组与Ⅱ组的湖羊母羊同期发情率、受胎率、产羔总数、产羔率、羔羊成活率、羔羊始重无显著差异(P>0.05)，这与王相生[33]的研究结果基本一致。说明ZEN含量不超过2 153 μg·kg-1的玉米经过10 kGy剂量60Co-γ辐照后，玉米中的ZEN被有效降解，符合国家标准，可以用作饲料正常饲喂繁育母绵羊。

4 结论

本研究结果表明，随着60Co-γ辐照剂量的增大，玉米含水量减少；辐照处理后玉米的淀粉颗粒及主要营养成分无显著变化。对试验Ⅲ组饲喂自然污染ZEN含量为2 153 μg·kg-1的玉米，发现试验Ⅲ组的澳洲白种公羊与试验Ⅱ组、Ⅰ对照组相比，采精量、精子活力、精子密度显著下降，精子畸形率显著上升。选用10 kGy剂量60Co-γ辐照后，玉米中ZEN降解率达83.7%；将辐照后的玉米饲喂试验Ⅱ组澳洲白种公羊后，其精液品质与Ⅰ对照组无显著差异；将辐照后的玉米饲喂试验Ⅱ组湖羊母羊，母羊发情率、受胎率、产羔情况和羔羊始重与Ⅰ对照组无显著差异。因此，ZEN含量低于2 153 μg·kg-1的玉米经10 kGy60Co-γ辐照后，可以正常饲喂繁育绵羊，对绵羊定时人工授精无显著影响。