菌糠多糖-纳米硒复合物的制备及其对水稻促生效果的研究

闫 佼 任新宇 魏宏宇 彭帅英 程 新,*

(1 江西农业大学应用微生物研究所，江西 南昌 330045；2 江西农业大学生物科学与工程学院，江西 南昌 330045)

硒(selenium)是人体生长必需的微量元素[1]，具有增强机体免疫活性[2]、抗衰老、抗肿瘤、抗氧化[3]等作用，对人体健康起到不可替代的作用。同时，硒可以促进植物生长发育[4]，提高植物中谷胱甘肽过氧化物酶的活性，防止膜脂质过氧化，保护生物膜不受损伤[5]，对植物生长繁殖具有重要的生物学意义。然而自然界中存在的无机硒和有机硒具有较高的毒性[6]，难以直接被动植物利用。因此如何对其进行改造以提高硒的生物利用率以及安全性已成为学术界研究的热点之一[7]，其中将硒元素制备成纳米硒已被证实是目前最为有效的改造方法之一[8]。

纳米硒的制备方法主要包括物理法、载体模板法和超声化学法[9]。物理方法制备得到的纳米硒可以通过调节激光参数来控制粒径大小，且不易受到化学试剂的污染，但因其制备效率和产量较低，未被广泛应用；化学法通常是通过亚硒酸钠与还原剂发生氧化还原反应制备纳米硒，但生成的纳米硒产物不稳定，且生物活性相对较低；而载体模板法是利用活泼基团来吸附包裹纳米硒粒子，防止纳米硒颗粒的聚沉，是目前常用的制备技术，蛋白质[10]、聚合物[11]、多糖[12]等均可作为载体模板来制备纳米硒。多糖作为一类生物大分子，因其所具有的特殊结构可以在构建纳米硒体系中发挥很好的悬浮、乳化以及稳定作用[13]，降低纳米硒颗粒表面的自由能，有效防止纳米硒颗粒的团聚，改善纳米硒的生物相容性，可以作为制备纳米硒复合物的最佳原料。

菌糠(spent mushroom substrate, SMS)是食用菌产业的废弃物[14]，含有大量多糖成分，但其开发利用一直未得到很好的解决，且有关利用菌糠多糖(polysaccharide from spent mushroom substrate)修饰纳米硒的报道尚未涉及过多。茶树菇(Agrocybecylindracea)是江西代表性食用菌品种，年产量达130万吨以上。茶树菇菌糠中含有糖类、有机酸类、生物活性酶等代谢产物，具有极高的利用潜力。本研究以茶树菇菌糠多糖为原料，探究菌糠多糖-纳米硒复合物的制备工艺，并通过形态学指标测定、抗氧化活性测定等手段，探索菌糠多糖-纳米硒复合物对水稻的促生效果，以期为利用菌糠多糖作为模板制备纳米硒复合物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验于2021年7月在江西农业大学实训基地内进行。茶树菇菌糠由抚州市黎川县江西利康绿色农业有限公司提供；水稻种子为五优308，由湖南隆平种业有限公司提供。选取颗粒饱满的水稻种子，浸泡于5%的次氯酸钠溶液中消毒15 min，用蒸馏水冲洗7～10次，直至无次氯酸钠气味。放置于28℃培养箱中，用蒸馏水浸泡24 h，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 茶树菇菌糠多糖的提取 茶树菇菌糠多糖的提取工艺参照赵泽文等[15]的方法进行。

1.2.2 菌糠多糖-纳米硒复合物的制备 吸取20 mL 0.1 mol·L-1的Vc溶液于锥形瓶中，添加10 mg·mL-1的菌糠多糖溶液，再加入10 mL 0.05 mol·L-1的亚硒酸钠(Na2SeO3)溶液，摇匀后置于恒温水浴锅中加热。通过改变茶树菇菌糠多糖的用量、反应时间、反应温度、抗坏血酸和亚硒酸钠的配比研究工艺参数对菌糠多糖-纳米硒复合物合成的影响(图1)。并根据胶体溶液的双波长比色法[16]，选用A410/A490值表征菌糠多糖-纳米硒复合物的粒径大小。

图1 不同溶液的紫外吸收光谱

1.2.3 菌糠多糖-纳米硒复合物体外抗氧化活性的测定 以Vc、亚硒酸钠、茶树菇菌糠多糖为阳性对照，分别测定菌糠多糖-纳米硒复合物的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, DPPH)自由基清除率[17]、羟基自由基清除率[18]、超氧阴离子自由基清除率以及还原力[19]。

1.2.4 水稻种子萌发及形态指标的测定 将用5%次氯酸钠浸泡消毒过的种子平铺在垫有两层滤纸的平板中，每个平板放30粒种子，分别用不同浓度的茶树菇菌糠多糖、亚硒酸钠和菌糠多糖-纳米硒复合物溶液处理培养，设置每种溶液处理的浓度分别为0、5、10、15、20 mg·mL-1，每个处理设置3个重复。每2 d更换一次处理液，28℃培养8 d备用。在水稻种子萌发至第3天时测定发芽势，第8天时测定种子发芽率、根长和芽长。

1.2.5 不同喷施方式对水稻幼苗生长的影响 将消毒后的种子平铺在垫有两层纱布的托盘中，28℃培养箱黑暗催芽48 h，保持纱布湿润。将长势一致的幼苗移至Hoagland营养液[20]中，以未添加菌糠多糖-纳米硒复合物为对照(CK)，设置根部添加(2、20 mg·L-1)和叶面喷施(2、20、100 mg·L-1)两种添加方式处理，每个处理设置3个重复。当水稻生长至三叶一心时，每2 d添加一次处理，当添加处理后水稻生长至第3和第10天时取样，用于测定生理指标。可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[21]，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法测定[22]，总黄酮含量采用分光光度法测定[23]，叶绿素含量采用分光光度法测定[24]，总酚含量采用Folin-Ciocalteu法测定[23]。

1.3 数据处理

所有数据均采用SPSS 25.0软件进行统计分析，采用Origin 2019软件进行作图，图表中数值为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 反应温度及反应时间对菌糠多糖-纳米硒复合物制备效果的影响

由图2可知，在不同的反应温度下，菌糠多糖-纳米硒复合物的A410/A490值均随时间的延长整体呈先上升后下降的趋势，并在反应4 h达到最大值，其中以50℃时的比值最大，达到2.05左右。由此可知，当反应温度为50℃、反应时间为4 h时制备的菌糠多糖-纳米硒复合物颗粒粒径最小、最均匀稳定。

图2 反应温度及反应时间对菌糠多糖-纳米硒复合物制备效果的影响

2.2 多糖占比以及Vc与亚硒酸钠配比对菌糠多糖-纳米硒复合物的影响

由图3-A可知，当Vc与亚硒酸钠的配比为2∶1和4∶1时，A410/A490值分别为1.45和1.40。有研究表明Vc在制备纳米硒的体系中可提供还原体系，使反应不断向生成菌糠多糖-纳米硒复合物的方向进行，有助于纳米硒的生成[24]，因此选择4∶1为最佳反应配比。由图3-B可知，菌糠多糖-纳米硒复合物的A410/A490值随着多糖占比的增加呈先上升后下降趋势，当菌糠多糖的体积分数为10%时，A410/A490值最大，为2.06，说明此时制备的菌糠多糖-纳米硒复合物产物均一稳定。

图3 多糖占比以及Vc与亚硒酸钠配比对菌糠多糖-纳米硒复合物的影响

2.3 菌糠多糖-纳米硒复合物的抗氧化活性

由图4可知，在试验范围内，菌糠多糖-纳米硒复合物的抗氧化活性均随浓度的增加呈现量效依赖关系，且明显高于同浓度下的菌糠多糖和无机硒。说明经过硒化后的菌糠多糖-纳米硒复合物对自由基的清除率有了明显提升。

图4 菌糠多糖-纳米硒复合物的体外抗氧化活性

采用SPSS软件分析菌糠多糖-纳米硒复合物及菌糠多糖自由基清除率的半数抑制率(median inhibition concentration，IC50)，结果如表1所示。菌糠多糖-纳米硒复合物清除3种自由基的IC50值相比茶树菇菌糠多糖均降低，说明菌糠多糖-纳米硒复合物清除自由基的能力得到了明显增强。

表1 纳米硒复合物自由基清除的IC50值

2.4 菌糠多糖-纳米硒复合物对水稻种子萌发的影响

由图5可知，与CK相比，菌糠多糖-纳米硒复合物显著提高了水稻种子的发芽率和发芽势，且其对发芽势的促进效果明显高于同浓度的菌糠多糖。菌糠多糖较CK显著提高了水稻种子的发芽率，但在相对较高浓度下，对水稻种子的发芽势有一定的抑制效果。菌糠多糖-纳米硒复合物可显著提高水稻种子的根长，且浓度越高，菌糠多糖-纳米硒复合物对根长的促进作用越明显。当菌糠多糖-纳米硒复合物浓度为5、10、15、20 mg·mL-1时，水稻种子根长分别较CK增加了224.06%、309.77%、406.02%、482.71%，而芽长并未随菌糠多糖-纳米硒复合物的加入而产生明显变化。菌糠多糖也不同程度地促进了水稻种子的根长，在浓度为5、10、15、20 mg·mL-1时，水稻种子根长分别较CK增加了45.11%、51.88%、33.08%、42.11%，但其促进效果显著低于菌糠多糖-纳米硒复合物。同时，菌糠多糖对水稻芽长表现出明显的抑制作用，与CK相比，芽长减少了76.68%、78.54%、77.40%、77.25%。从图6也可看出不同处理条件下水稻种子的萌发情况有明显差异。

注：不同小写字母表示同一浓度不同处理间差异显著(P<0.05)。

图6 不同处理条件下水稻种子的根长、芽长变化

2.5 不同喷施方式对菌糠多糖-纳米硒复合物促进水稻幼苗生长的效果

2.5.1 不同喷施方式对水稻幼苗根茎叶发育的影响 由表2可知，叶面喷施菌糠多糖-纳米硒复合物对水稻幼苗根和茎的影响较大。与CK相比，叶面喷施菌糠多糖-纳米硒复合物浓度为20 mg·L-1时，第3天水稻幼苗的根长和茎长分别增加了18.09%、19.10%，第10天水稻幼苗的根长和茎长分别增加了32.28%、26.36%，说明叶面喷施的处理方式对水稻幼苗的生长有明显促进作用。根部添加菌糠多糖-纳米硒虽然在一定程度上促进了水稻幼苗的生长，但促生效果低于叶面喷施处理。

表2 不同喷施方式对水稻幼苗根茎叶的影响

2.5.2 不同添加方式对水稻幼苗可溶性糖、可溶性蛋白及叶绿素含量的影响 由图7可知，与CK相比，叶面喷施菌糠多糖-纳米硒复合物明显提高了水稻幼苗的可溶性蛋白、可溶性糖及叶绿素含量，并且其含量整体随浓度的增大而呈先上升后下降的趋势。根部添加2 mg·mL-1菌糠多糖-纳米硒复合物对第3天水稻根部可溶性蛋白含量的影响较大(图7-A)。在第10天，叶面喷施菌糠多糖-纳米硒复合物浓度为20 mg·L-1时，水稻幼苗的根部和叶片可溶性蛋白含量最高，分别为1 450和2 850 μg·g-1，比对照分别提高了72.62%和27.80%(图7-B)。第3天时，根部添加2 mg·L-1菌糠多糖-纳米硒复合物使根中可溶性糖含量较CK显著增加，而当处理至第10天时，叶面喷施菌糠多糖-纳米硒复合物对水稻叶面可溶性糖的影响较明显，当复合物施用浓度为20 mg·L-1时，叶片中可溶性糖含量相比CK增加了180.87%(图7-D)。在处理至第10天时，叶面喷施20 mg·L-1菌糠多糖-纳米硒复合物的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量分别比CK显著增加了67%、58%、21%(图7-F)。综上，根部添加菌糠多糖-纳米硒复合物对水稻幼苗根部的影响明显高于叶面，提高了水稻幼苗的可溶性糖、可溶性蛋白含量，但随着水稻生长周期的增加，根部添加处理对水稻生长的促进速率明显低于叶面喷施的促生速率。

注：图中不同小写字母表示同一部位及类型间差异显著(P<0.05)。下同。

2.5.3 不同添加方式对水稻幼苗中总酚和总黄酮含量的影响 由图8可知，叶面喷施菌糠多糖-纳米硒复合物浓度为100 mg·L-1时，第3和第10天的总酚与总黄酮含量均显著高于CK，其中第10天水稻根部和叶面的总酚含量相比CK分别增加了311%、27.8%，总黄酮含量相比CK分别增加了300%、42.5%，且根部的提升效率高于叶面。根部添加菌糠多糖-纳米硒复合物虽然在一定程度上增加了水稻幼苗根部和叶面的总酚和总黄酮含量，但相比叶面喷施处理的促进效果略低。并且随着水稻幼苗生长天数的增加，总酚和总黄酮含量出现明显累积现象。

图8 不同添加方式对水稻幼苗总酚和总黄酮含量的影响

2.5.4 不同添加方式对水稻幼苗中硒含量的影响 由图9可知，当叶面喷施菌糠多糖-纳米硒复合物浓度为20 mg·L-1时，第3和第10天的水稻幼苗叶面硒含量均高于根部和茎部，并且显著高于CK，其中第10天的水稻幼苗叶面硒含量为12.7 mg·g-1，是CK的25倍。虽然根部添加处理也促进了水稻幼苗的硒含量，但其明显低于叶面喷施处理。

图9 不同添加方式对水稻幼苗的硒含量的影响

3 讨论

近年来，以多糖为模板制备纳米硒日益受到关注。Wang等[25]采用化学还原法制备了羊栖菜多糖纳米硒，结果表明以多糖螯合制备的纳米硒对羟基自由基和DPPH自由基的清除能力均强于裸纳米硒，但低于羊栖菜多糖。Lian等[26]研究发现以甘草多糖硒化得到的纳米硒抗氧化能力稍强于甘草多糖，比小分子抗氧化剂更能有效地抵抗自由基引起的损伤，显示出其作为抗氧化剂的潜力。本研究以菌糠多糖为模板所制备的纳米硒复合物对自由基的清除率明显高于茶树菇菌糠多糖和无机硒，而进一步的水稻栽培试验也证实，菌糠多糖-纳米硒复合物的促生效果明显高于单一的菌糠多糖，说明硒化多糖的生物学活性提升可能与多糖的种类与结构有关，但需要进一步研究证明。

有关纳米硒在农业方面的应用已被广泛报道。研究表明，纳米硒在一定程度上可以促进作物生长，提高作物的品质和抗逆性{26]。Domokos-Szabolcsy等[27]研究发现较高浓度纳米硒可以显著促进烟草的根系生长，在265～530 μmol·L-1浓度范围内，刺激了根的伸长，使得根系分布更加广泛和密集，而硒酸盐在任何浓度下对烟草的生长均有抑制作用，抑制了根的再生。本研究同样发现，菌糠多糖-纳米硒复合物在较高浓度下对水稻生长起促进作用，较低浓度下则抑制水稻的生长，适宜浓度的纳米硒可以提高水稻对营养物质的吸收，进而促进水稻生长。Li等[28]研究发现将纳米硒喷施在辣椒叶片上，有助于提高辣椒素、类黄酮和总酚的合成，并且纳米硒处理可促进植物激素合成基因的表达，提高茉莉酸、脱落酸和水杨酸水平，降低丙二醛和羟基自由基水平，从而促进次生代谢产物和抗氧化剂的积累。本研究发现，菌糠多糖-纳米硒复合物添加提高了水稻幼苗中总黄酮和总酚的含量，推测可能是由于纳米硒具有较强的抗氧化能力，刺激水稻幼苗产生多种抗氧化物质，进而提高了水稻幼苗的抗氧化能力。肖贤等[29]通过水培试验研究了不同浓度纳米硒对豌豆芽苗生长品质、抗氧化活性及硒含量的影响，结果表明施用纳米硒后豌豆芽苗的生物量明显提高，光合作用效率和抗氧化活性显著提高，同时还增加了豌豆芽苗中的硒含量。当植物生长发育受到环境胁迫时，纳米硒可能会干扰植物的光合作用，打开叶面气孔，促进蒸腾作用，增加光合速率，从而调节逆境中植物的生长发育。在本试验结果中，叶面喷施菌糠多糖-纳米硒显著提高了水稻幼苗的硒含量。一般而言，硒酸盐主要是通过主动吸收被植物利用，而亚硒酸盐主要通过磷转运蛋白。Wang等[30]通过水培试验研究了纳米硒在水稻中的吸收转化和亚细胞分布情况，并与亚硒酸盐和硒酸盐进行了比较，结果表明水稻根系对纳米硒的吸收速率大约是硒酸盐或亚硒酸盐的1.7倍，经过纳米硒和亚硒酸盐处理的水稻植株吸收的硒大部分分布在细胞壁上，被水稻植株吸收后迅速同化为有机形式。本研究发现，菌糠多糖-纳米硒复合物促进了水稻种子的萌发，亚硒酸钠则明显抑制了水稻种子的萌发，说明水稻种子对纳米硒的吸收速率强于无机态的亚硒酸盐。

研究发现土壤添加硒肥后，只有少部分被农作物吸收利用，大部分则会被土壤吸附固定，造成农作物硒利用率低的现象，而叶面喷施硒肥提高了硒的吸收转化率，显著提高了水稻的富硒量和生物活性[31]。Badawy等[32]认为叶面喷施纳米硒是提高水稻耐盐性和产量的有效途径，在水稻的不同生长阶段进行叶面喷施可提高根系生物量，维持细胞适当的渗透状态，并提高水稻的叶绿素含量。本研究发现，叶面喷施菌糠多糖-纳米硒复合物提高水稻幼苗的叶绿素含量，原因在于适量纳米硒的使用可以增加植物的气孔导度，提高水稻幼苗的光合速率，促进水稻叶绿素的合成，进而提高水稻幼苗中叶绿素的含量。Zahedi等[33]研究发现，叶面喷施纳米硒颗粒减轻了干旱胁迫对石榴树叶片和果实的不利影响，增强了叶片光合能力，提高了生物量。本试验对水稻叶面喷施菌糠多糖-纳米硒复合物也明显促进了水稻幼苗的生长，与前人研究结果[34]一致。菌糠多糖-纳米硒复合物促进水稻幼苗生长的原因在于，纳米硒的使用促进了水稻幼苗对营养物质和微量元素的吸收和转运，同时促进水稻的生理代谢，进而提高了水稻的根系活力。综上，适宜浓度的纳米硒对农作物的生长具有促进作用，提高了农作物的生理代谢、元素吸收以及富硒水平。原因可能在于低浓度的硒能够上调过氧化酶和还原酶等抗氧化酶的活性，从而增强植物对不利因素的抵抗能力。

不同来源的食用菌菌糠的成分和理化性质差异较大，因此利用难度大，利用率偏低[35]，并且菌糠原料本身极易存在或产生相关毒素[36]，存在安全隐患，因此如何加工利用菌糠是目前亟待解决的问题，其中开发菌糠中的活性成分成为行之有效的一种方法。本研究结果显示菌糠中的多糖对农作物生长发育有较大影响，以菌糠多糖为原料制备的菌糠多糖-纳米硒复合物对水稻有较好促生效果。该研究结果在农业领域具有较好的应用前景，可为菌糠的精深加工提供新思路。

4 结论

本研究以茶树菇菌糠多糖为模板还原亚硒酸钠，制备得到了菌糠多糖-纳米硒复合物，结果表明，当反应温度为50℃、反应时间为4 h、Vc与亚硒酸钠的配比为4∶1、多糖体积分数为10%时，可以获得颗粒粒径较小、均一稳定的产物颗粒。与菌糠多糖和亚硒酸钠相比，菌糠多糖-纳米硒复合物表现出较强的体外抗氧化活性。此外，相比根部添加处理，叶面喷施菌糠多糖-纳米硒复合物显著促进了水稻幼苗生长。