茶树不同叶位碳氮氢氧稳定同位素分布及变化特征

夏 魏 聂 晶 李 鑫 李春霖 邵圣枝 李祖光 袁玉伟,*

(1 浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所，浙江 杭州 310021；2 浙江工业大学化学与工程学院，浙江 杭州 310014；3 中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；4 农业农村部农产品信息溯源重点实验室，浙江 杭州 310021)

茶叶是用茶树(Camelliasinensis)新鲜叶片经过特殊加工工艺制成，属于世界三大饮料之一[1]。因其富含多种有益于人体健康的活性成分和抗氧化物质而广受人们喜爱，如茶多酚、氨基酸及微量矿质元素等[2]。茶叶的生产季节、采摘标准是评价茶叶品质的重要因素[3]，而这与茶叶的叶位和成熟度密切相关。茶叶中稳定性同位素碳同位素(δ13C)、氮同位素(δ15N)、氢同位素(δ2H)和氧同位素(δ18O)具有产地溯源特征，而关于茶树叶片稳定同位素随叶位变化和时间变化的规律和特征尚不明确。

近些年，稳定同位素技术已广泛应用于诸多农产品研究中[4-5]，如蔬菜[6]、肉类[7]、牛奶[8]、水果[9]等。该技术在茶叶中也有相关应用，如鉴别不同产地[10]、不同品种[11]以及不同生产期[12-13]的茶叶。利用同位素技术区分不同国家的茶叶，如中国、印度和斯里兰卡，也可用于小范围的溯源研究，如不同省份及市级(地域间距小于200公里)[14]。除此之外，有研究报道叶片成熟度也是影响茶叶溯源鉴别的重要因素之一[11,15-16]。Liu等[11]对龙井茶的嫩叶与老叶进行对比，发现嫩叶中δ15N高于老叶。Xia等[13]对不同时期的嫩叶与成熟叶进行分析，发现嫩叶与成熟叶的同位素富集特征存在显著差异。叶片是植物进行光合作用合成有机物的主要场所，有机物的累积过程是形成茶叶品质的重要阶段[17]。茶叶中茶多酚类物质占叶片干重的20%～35%，由30种以上的酚类物质组成，是一种天然的抗氧化剂[18-20]。茶叶中氨基酸约占1%～4%，主要以茶氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸和精氨酸为主。研究报道，叶片中茶多酚和氨基酸的合成会随叶片不断生长而产生新的变化[21]。茶叶稳定同位素的特征变化与叶片成熟度也存在一定相关性，如氮元素主要来源于根系的吸收，不同外源氮的同位素会直接导致植物体氮同位素的变化[11]。此外，在植物的生长过程中，氮在植物体中经转运和分配会造成氮同位素丰度差异，有研究表明氮稳定同位素与植物叶片的叶龄有关[22-23]。因此，茶叶采摘叶位和时间(季节和年份)的不同可能会影响其稳定同位素变化，但茶叶稳定同位素δ13C、δ15N、δ2H和δ18O随叶位及时间的变化规律尚不明确。

本研究以茶叶为研究对象，利用稳定同位素技术探究茶叶稳定同位素δ13C、δ15N、δ2H和δ18O在不同叶位的分布及其随时间变化特征，旨在进一步明确茶树不同叶位中稳定同位素的分馏规律，为研究相关的分馏机制奠定基础，同时为数据库构建提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验茶叶样本来源于中国农业科学院茶叶科学研究所嵊州茶叶种植基地。茶树品种为龙井43#。采样时间为2019年8月9日、8月17日、8月31日、9月11日和9月27日。每次选取长势相近的10个枝条，从顶端向下分离10片叶子并依次进行编号，共计10个样本，如图1所示。5次共采集50个不同叶位的茶叶样本。

图1 茶树枝条10个叶位叶片样本的编号示意图

稳定同位素比率分析采用国际原子能机构(International Atomic Energy Agency, IAEA，奥地利)的标准物质：CH-6(蔗糖，δ13CV-PDB=-10.449‰±0.033‰)，IAEA-600(咖啡因，δ13CV-PDB=-27.771‰± 0.043‰，δ15Nair= 1.0‰±0.2‰)，IAEA-601(苯甲酸，δ18OV-SMOW= 23.14‰±0.19‰)，IAEA-602(苯甲酸，δ18OV-SMOW= 73.35‰±0.39‰)，IAEA-N-2(硫酸铵，δ15Nair=20.3‰±0.2‰)，IAEA-CH-7(聚乙烯，δ2HV-SMOW=-100.3‰±2.0‰)；英国Elemental Microanalysis公司的标准物质：B2203(δ2HV-SMOW=-25.3‰±1.1‰)、B2155(δ15NAir= 5.94‰±0.08‰)、B2174(δ13CV-PDB=-37.421‰±0.017‰)，进行两点法校正。氢氧化钠(NaOH)和五氧化二磷(P2O5)购自德国默克Supelco公司；玻璃碳、炭黑、氧化铜(CuO)、三氧化二铝(Al2O3)、线状还原铜、锡杯和银杯(尺寸规格: 4 mm × 4 mm × 11 mm)购自德国Elementar公司。

1.2 主要仪器与设备

Vario PYRO cube元素分析仪、Isoprime 100型同位素比率质谱仪，德国Elementar公司；SCIENTZ-10 N/A型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 样本预处理

将鲜叶样本置于-20℃条件下冷冻24 h，然后放入-60℃的冷冻干燥设备中干燥48 h，最后将干燥的样本加入液氮研磨成粉，装样待测。

1.4 稳定同位素比率检测

1.4.1 碳、氮稳定同位素测定 参照袁玉伟等[24]的方法，采用元素分析仪一稳定同位素比质谱(elementary analyzer-stable isotope ratio mass spectrometers, EA-IRMS)测定茶叶δ13C和δ15N值。称取2.0～4.0 mg(响应度为2～10 nA)样品至锡箔杯中，包样后将样品置于元素分析仪中。样品中的碳元素和氮元素分别转化为纯净的CO2和N2气体，再经稀释后进入同位素质谱仪检测。具体参数：氧化炉和还原炉温度分别为920和600℃，He吹扫流量230 mL·min-1；同位素质谱检测时间550 s，参考气为高纯度的CO2和N2。

1.4.2 氢、氧稳定同位素的测定 参照袁玉伟等[24]的方法，采用EA-IRMS测定茶叶δ18O和δ2H值。称取0.3～0.6 mg样品于银杯包好后置于元素分析仪中，经燃烧炉产生的H2和CO进入同位素质谱仪进行检测。具体参数：He流量125 mL·min-1，燃烧炉温度1 450℃；同位素质谱检测时间950 s，参考气为高纯度的H2和CO。

1.4.3 稳定同位素比率计算 由于自然界中重同位素自然丰度极低，导致试验仪器获取的稳定同位素比率值(R)极小。国际上，通常将已知同位素比率的标准品作为参照，计算未知样本中稳定同位素比率的相对值。计算公式为：

δ=[(R样品/R标准)-1]×1 000‰

(1)

式中，R样品为所测样品中重同位素与轻同位素的丰度比，即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H；R标准为国际标准样品中重同位素与轻同位素的丰度比[17]。

δ13CV-PDB采用IAEA稳定同位素比率初级标准品CH-6、IAEA-600进行两点法校正，δ15Nair采用IAEA-N-2、IAEA-600标准物质值校正，δ18OV-SMOW采用IAEA-601、IAEA-602标准物质值校正，δ2HV-SMOW采用B2203、CH-7标准物质值校正。该测定计算方法下，δ13C的精确度为±0.1‰，δ15N和δ18O的精确度均为±0.2‰，δ2H的精确度为±3‰。

相邻叶位同位素分馏系数计算公式如下：

(2)

式中，E为待分析元素，i表示较重原子的质量数。

1.5 数据分析

采用单因素方差(single-way analysis of variance, ANOVA)分析不同叶位稳定同位素分布特征，采用最小显著差值法(least significant difference method, LSD)评价稳定同位素与叶位之间的差异程度，各组数据间的显著差异定义为P<0.05。以上数据分析用SPSS 19.0软件完成。

2 结果与分析

2.1 不同叶位中δ13C和δ15N分布特征

探究不同叶位稳定同位素分布特征在一定程度上能了解茶叶的生长状况及变化规律，10个叶位δ13C和δ15N分布特征与分馏系数如表1所示。

表1 茶树不同叶位中δ13C和δ15N的分布特征与分馏系数

不同叶位叶片δ13C变化范围为-27.7‰～-23.4‰。通过线性相关分析可知，叶位与δ13C具有较强负相关性(R2= 0.98,P<0.05)，呈现随叶位增加而贫化的特征，相邻叶位差异值约0.19‰～0.48‰。相邻叶位间分馏系数为1.000，表明不同叶位δ13C具有特定向下贫化的分馏规律，可作为茶树生长过程中叶片成熟度的重要指标。

叶片δ15N的变化范围为0.9‰～6.3‰，与叶位之间表现出较强负相关性(R2= 0.93,P<0.05)，呈现随叶位增加而贫化的特征，相邻叶位相差值为0.05‰～0.55‰。相邻叶位间分馏系数范围为0.999～1.000，表明随着叶位增加，δ15N具有贫化的分馏规律特征。

2.2 不同叶位中δ2H和δ18O分布特征

茶树不同叶位中δ2H和δ18O分布特征如表2所示。δ2H变化范围为-138.9‰～-65.3‰，与碳和氮同位素的变化特征相似，表现出较强的相关性(R2= 0.97,P<0.05)，呈现随叶位增加而贫化的特征，相邻叶位相差为2.4‰～7.3‰。相邻叶位间分馏系数范围为0.992～0.997。

表2 茶树不同叶位中δ2H和δ18O的分布特征与分馏系数

不同叶位中δ18O变化范围为18.2‰～25.2‰，δ18O与叶位之间呈现一定的线性关系(R2= 0.71,P<0.05)，但其相关性低于δ13C和δ15N。相邻叶位间分馏系数范围为0.999～1.001。在第1～第3叶位中，呈现上升富集趋势，第4～第6叶位恒定为21.0‰～25.0‰，第7～第10叶位叶片呈现贫化趋势。第2～第6叶位叶片中氧稳定同位素值较高，结合植物光合作用机制可知该部位是叶片生理代谢较强的场所，说明δ18O可作为植物代谢强弱的有效指标。

2.3 不同叶位δ13C、δ15N、δ2H和δ18O随采集时间的变化特征

在茶叶的生产中，主要采摘顶端叶片，如一芽一叶、一芽二叶和一芽三叶。因此，选取前三叶位叶片进行5个采样时间分析。

不同叶位δ13C和δ15N随时间的变化特征如图2所示。茶树前三叶位叶片δ13C从8月9日(约-25.5‰)到9月27日(约-24.0‰)呈现富集的特征。不同叶位叶片δ13C变化规律不同，除了第1叶位逐渐增加，第2和第3叶位在8月31日达到次大值，随后下降后而缓慢上升。δ13C与环境因子(光照、温度和降雨)密切相关[13,25]。本研究中叶片采集时间跨越夏季与秋季，气候变化差异较大，导致δ13C总体呈富集的特征。茶树前三叶位叶片δ15N整体变化与δ13C相似，从8月9日(约2.7‰)到9月27日(约5.0‰)也呈富集特征。第1和第2叶位逐渐增加，第3叶位在9月11日达到峰值，之后贫化分馏。此外，前4个时间段采集叶位叶片的同位素值相近，在最后一次的采摘中不同叶位的同位素值具有一定的差异。

图2 不同叶位δ13C和δ15N随时间的变化特征

不同叶位δ2H和δ18O随时间的变化特征如图3所示。前3叶位叶片δ2H和δ18O按照初始和末次采样相比较总体也呈富集特征，但中间的变化较δ13C和δ15N复杂。3个叶位的δ2H在初次采样期(8月9日)平均约为-80‰，但在第二次采样(8月17日)达最贫化值(约-107.0‰)，然后经后面的2个采样日期(8月31日与9月11日)缓慢富集，在最后一次采样日期(9月27日)平均为-78.0‰，不同叶位的同位素比值和变化趋势基本相同。3个叶位的δ18O在初次采样期(8月9日)约为23.0‰，在第二次采样(8月17日)也达最贫化值(约21.0‰)，在第三次采样期(8月31日)富集，约为22.0‰，在第四次采样(9月11日)又表现出了贫化效应，δ18O约21.7‰，最后一次采样期(9月27日)呈富集特征，约为24.5‰。第2和第3叶位的δ18O变化趋势基本相似，第1叶位的变化更为剧烈。

图3 不同叶位δ2H和δ18O随时间的变化特征

3 讨论

植物中碳元素累积与叶片光合作用过程密切相关，气候环境变化是影响光合作用的主要因素，本研究进一步揭示了茶树不同叶位δ13C随时间的变化特征。同时，δ13C作为衡量光合强弱的指标，本研究中的数据也间接反映了不同叶片的光合特征。δ15N是叶片中营养物质的重要组分。植物体中δ15N的分馏主要与含氮化合物的运输和分配有关[26]。当叶片处于自养阶段、异养阶段或兼容两者阶段时，δ15N通常会发生分馏效应，光合作用较强的叶片中较轻14N会被优先利用分配。通常初生新叶(嫩叶)光合能力较强，较重15N会滞留于光合能力较弱的叶片中(老叶)[27-28]。本研究结果表明，叶片中δ15N同位素具有顶端嫩叶富集特征，而老叶因具有较弱的代谢能力表现出δ15N贫化特征，因此δ15N可作为指示叶片代谢活跃度的重要指标。

茶树叶片中δ2H主要来源于降雨，如根部吸收的地下水和叶片气孔获取空气中的水分。δ2H的分馏规律特征与叶片有机物质合成和营养物质分配运输的过程有关[29-30]。叶片δ18O主要来源于大气CO2和H2O，植物光合作用生产有机物的过程与CO2吸收同化有较大关联[31]，据此推测相比于其他叶位叶片，本研究第2～第 5叶片中有更多的δ18O来源于CO2中的氧元素。而其他叶位的叶片由于缺乏相对较强的光合作用能力，属于被输送或异养型对象。相对于δ13C、δ15N和δ2H，δ18O更能衡量植物综合生理代谢的能力。

植物中稳定同位素是与气候环境密切相关的指标，与植物在特定环境中生长的生理代谢有关[32-33]，茶叶稳定同位素会随季节发生变化，这与叶片光合作用合成有机物过程以及营养物质的分配运输有直接的关联。然而，关于茶叶稳定同位素对气候环境变化的响应还不清楚，其内在机理还需进一步深入研究。

4 结论

本试验系统研究了茶树10个叶位δ13C、δ15N、δ2H、δ18O的分布特征，明确了第1～第3叶位同位素特征随时间变化的规律。随叶位自上而下，δ13C、δ15N 和δ2H逐渐贫化，而δ18O在第2到第5叶位保持较高的值，而后也逐渐贫化。第1～第3叶位同位素特征的时间变化具有差异，δ13C和δ15N总体呈富集性特征，但δ2H和δ18O呈现出先贫化后富集的变化特征。本研究结果为探究茶树不同叶位传统稳定同位素的分馏机制提供了参考，为同位素数据库构建奠定了基础。